在分子診斷試劑中，為什么會出現(xiàn)假陰性結果？

大家好，我是劉博，今天我們來探討，為什么分子診斷會出現(xiàn)假陰性結果，以及我們需要采用什么樣的質控措施來避免出現(xiàn)假陰性結果。

核酸檢測結果被抑制的原因，一般是由于在反應體系當中存在某些物質，它們會對我們目標序列產(chǎn)生干擾，從而導致出現(xiàn)假陰性或者假陽性結果。

對于很多分子診斷試劑而言，都需要依賴酶的活性才能發(fā)揮作用（例如，DNA和RNA聚合酶，逆轉錄酶等等）。這些酶可能需要輔助因子或者在一些特定的條件下才能獲得最佳活性，例如，酶促反應通常需要底物與與酶上的特定結合位點結合后，通過相互之間的物理作用（如范德華力）來實現(xiàn)。

如果在樣品當中，存在一種物質可以與這些重要的輔助因子結合，或者可以改變局部環(huán)境，又或者可以阻擋酶的活性部分，那么在這種情況下，都有可能會抑制擴增反應，從而導致假陽性結果的出現(xiàn)。

樣本當中的很多成分都可以通過與酶促反應的成分發(fā)生相互作用來抑制核酸的靶向擴增。例如，血紅素及其代謝產(chǎn)物是已知的DNA聚合酶抑制劑；不同來源的聚合酶可能會受到不同濃度的影響；酸性多糖是存在于痰中的糖蛋白的成分，是已知的聚合酶的抑制劑；CSF、尿液和痰液也可能含有DNA聚合酶抑制劑，但其抑制性成分還沒有被定性；糞便中的膽汁鹽是PCR強抑制劑；抗凝血劑肝素與DNA聚合酶結合，是依賴這些酶的核酸擴增方法的強效抑制劑。

我們可以采用對樣品進行的稀釋方式，來減少抑制作用的存在，但這也有副作用，那就是由于目標DNA被稀釋了，診斷試劑本身的靈敏度也可能會降低。如果我們需要評估一個分子診斷試劑的性能的話，可以考慮購買一些商業(yè)化的抑制檢測血清盤，這樣我們就可以在已知抑制物存在的情況下，對其進行評估。

這些抑制物質在采用直擴法的分子試劑當中會比較常見，但對于采用提取方法進行的實驗而言，影響并不會太大，具體可見下文

還有一種可以有助于減少抑制的方法就是在反應體系中，加入對目標序列的捕獲步驟，這樣我們就可以在擴增前去除潛在的抑制基質成分。在有些提取方法當中，還包括有純化步驟，可以將核酸與樣品中的其他物質相分離。

在臨床樣品當中，也可能含有核酸酶，會將目標核酸降解，從而導致目標核酸無法被檢測到。此外，許多用于純化核酸的試劑（如苯酚、EDTA、十二烷基硫酸鈉等洗滌劑、有機溶劑、鹽酸胍等變色劑）如果與目標核酸共存，可能對擴增酶有抑制作用。另外，實時PCR擴增中使用的高濃度的熒光雙鏈DNA（dsDNA）插層染料也會產(chǎn)生抑制作用。

對于多重反應而言，它會面臨另外一種抑制作用，當一個目標序列對脫氧核苷三磷酸酯（dNTPs）或其他基本反應成分的競爭超過另一個目標時，就會發(fā)生競爭性抑制，這會導致第二個目標序列無法被檢測到。

我們還可以考慮使用各種促進劑來加強擴增反應并限制抑制劑的影響，例如，甲酰胺、牛血清白蛋白、二甲亞砜、甘油、乙酰胺、甜菜堿、葡聚糖、壬基酚-40和聚乙二醇。

以上文章來源于診斷科學 ，作者認真的劉博。