腫瘤檢測：選擇NGS還是PCR？

高通量基因測序技術(shù)（NGS）是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的前沿技術(shù)之一，其在研究領(lǐng)域的應(yīng)用加速了我們從基因組學(xué)層面對生命現(xiàn)象包括人類疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律的理解，從而大大推動了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展進程。

隨著NGS技術(shù)的日漸成熟，其應(yīng)用于臨床分子診斷的潛力，特別是應(yīng)用于腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療相關(guān)的基因檢測，已成為行業(yè)共識。相比PCR檢測技術(shù)，NGS技術(shù)可一次性檢測多個基因位點和多種基因變異形式，高通量、廣覆蓋，在臨床多基因檢測需求逐步增加的情況下，NGS大有取代PCR的勢頭。

當(dāng)下，NGS與PCR技術(shù)在臨床應(yīng)用中的情況又如何呢？現(xiàn)實和我們許多人的想象存在巨大的差距！

臨床應(yīng)用差距

1、NGS院內(nèi)檢測滲透率遠(yuǎn)不及PCR

院內(nèi)檢測始終是腫瘤患者進行合規(guī)檢測的主要且最佳途徑，筆者對全國1196家三甲醫(yī)院分子檢測開展情況進行了調(diào)研，結(jié)果顯示：有639家（53.4%）反饋開展了分子檢測。在這639家中，NGS檢測的開展量只有32.6%（208家），而幾乎所有醫(yī)院均開展了PCR檢測(575家，90.0%)，其他還有FISH檢測（368家，57.6%），一代測序（106家，16.6%），ddPCR檢測（33家，5.2%），開展量均不及PCR檢測。

2、NGS真實世界臨床應(yīng)用中的檢測性能尚不及PCR

必須強調(diào)的是，NGS的優(yōu)點是多和全，而不是更準(zhǔn)確。事實上，到目前為止，其綜合檢測性能尚不及PCR。

中國抗癌協(xié)會腫瘤病理專業(yè)委員會分子病理協(xié)作組聯(lián)合國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)評審中心臨床與生物統(tǒng)計二部，對我國過去十年肺癌分子檢測臨床應(yīng)用及我國藥監(jiān)部門相關(guān)產(chǎn)品審批情況做了深入研究。根據(jù)對49家大型醫(yī)院的調(diào)研數(shù)據(jù)，繪制了2010年至2019年中國大陸地區(qū)非小細(xì)胞肺癌分子病理檢測的整體情況。以非小細(xì)胞肺癌主要驅(qū)動基因EGFR、ALK、ROS1的檢測為例，NGS檢測的陽性率分別為41%、4.33%、1.38%，PCR檢測的陽性率分別為42.3%、6.59%、1.62%[1]。相比NGS檢測，PCR檢測可以篩選出更多陽性患者，避免部分患者被當(dāng)成驅(qū)動基因陰性狀態(tài)進行治療的現(xiàn)象，最大程度上保障了患者的利益。

NGS及PCR檢測陽性率

日本癌癥研究中心的后藤·功一教授（Prof. Koichi Goto）教授團隊近日在領(lǐng)域知名期刊《Lung Cancer》上發(fā)表的文章也對PCR試劑及NGS試劑的臨床應(yīng)用性能進行了頭對頭的比較，數(shù)據(jù)顯示：以中國腫瘤精準(zhǔn)診斷龍頭企業(yè)艾德生物的PCR-11基因為代表的PCR試劑，對比美國分子診斷龍頭企業(yè)賽默飛的NGS試劑（OPA（Oncomine Precision Assay）和OCA（Oncomine Comprehensive Assay V3）），在檢測成功率、陽性率及檢測周期方面，均表現(xiàn)出更優(yōu)異的性能[2]。

PCR試劑與NGS試劑臨床應(yīng)用性能對比數(shù)據(jù)

導(dǎo)致差距原因分析

無論是院內(nèi)開展情況，還是檢測陽性率、臨床應(yīng)用性能方面，到目前為止，NGS的表現(xiàn)均遜色于PCR。那么是什么原因?qū)е铝诉@種差距呢？

1、技術(shù)平臺成熟度、特點及普及度決定了臨床應(yīng)用滲透率

PCR技術(shù)成熟，檢測快、操作簡單，報告周期短、費用便宜、易于推廣且已進入臨床應(yīng)用多年，是目前主流臨床基因檢測技術(shù)平臺。我國藥監(jiān)局批準(zhǔn)上市的腫瘤基因檢測試劑中，超過80%為PCR試劑。同時，經(jīng)過疫情期間核酸檢測能力的建設(shè)，我國絕大多數(shù)二甲及以上醫(yī)院都已具備PCR檢測的能力，必將加速推進PCR試劑的臨床普及應(yīng)用。

反觀NGS技術(shù)，雖然這幾年發(fā)展迅速，但臨床普及應(yīng)用仍處于起步階段。NGS實驗操作復(fù)雜、報告周期長、費用昂貴的問題仍期待更為有效的解決方案。截止目前，國家批準(zhǔn)上市的NGS試劑不多，NGS基因檢測多以實驗室自制試劑（LDT）的模式實現(xiàn)商業(yè)化，這種繞開醫(yī)院自身的檢測流程與相關(guān)監(jiān)管部門倡導(dǎo)的檢測模式相悖，于患者和醫(yī)生而言均存在較大風(fēng)險，發(fā)展瓶頸難以突破。

回到NGS最大的優(yōu)點——檢測范圍廣，從必要性角度來探討，依然存在兩大鴻溝：就靶向治療現(xiàn)有需要檢測的靶點而言，即使是在靶向藥物最多的肺癌領(lǐng)域，已上市藥物的靶點數(shù)也不超過10 個，用簡便快捷、費用低、普及度高的多重PCR技術(shù)就可實現(xiàn)，NGS展現(xiàn)的是劣勢不是優(yōu)勢；就目前我國NMPA批準(zhǔn)的NGS試劑而言，其獲批檢測基因的數(shù)量最多的也僅10個基因，從合規(guī)層面來看，NGS檢測范圍廣的優(yōu)勢應(yīng)用到臨床上，依然需要面對法規(guī)監(jiān)管的挑戰(zhàn)。

2、PCR技術(shù)也在不斷“進化”

PCR技術(shù)與臨床需求同頻共振，持續(xù)創(chuàng)新發(fā)展。在基因數(shù)量上，從單基因檢測到多基因檢測；在核酸類型上，從檢測DNA突變到同時檢測DNA突變和RNA融合；在適用樣本類型上，從FFPE樣本到活檢小樣本、胸水、血液等。PCR技術(shù)全面滿足了臨床需求，特別是針對臨床上令人頭疼的核酸片段化及RNA融合檢測問題方面，PCR技術(shù)完全可以實現(xiàn)對小片段核酸以及對RNA融合的高靈敏、穩(wěn)定檢測。這意味著，即使在沒辦法獲得足量、高質(zhì)量標(biāo)本的情況下，依然可以使用PCR技術(shù)進行檢測，不讓患者因此錯失治療機會。這一點，PCR比NGS更符合臨床實際需求。

3、NGS技術(shù)繁雜度、穩(wěn)定性及基因檢測產(chǎn)品設(shè)計科學(xué)性有待進一步優(yōu)化

如果把PCR檢測比作分子檢測的“入門級”，NGS檢測則是“王者級”。NGS檢測流程復(fù)雜，分濕實驗和干實驗兩大部分：濕實驗又包括文庫構(gòu)建、探針雜交、磁柱捕獲、目標(biāo)片段擴增和上機測序；下機后的測序數(shù)據(jù)要經(jīng)過數(shù)據(jù)質(zhì)控、序列比對、變異注釋、臨床解讀等干實驗才能出具最終報告。實驗步驟的增加，不僅提高了對實驗人員技能的要求，也增大了實驗錯誤的發(fā)生概率。實驗過程中任何一個微小失誤都可能導(dǎo)致錯誤的結(jié)果產(chǎn)出，這也是NGS檢測穩(wěn)定性往往不盡如人意的原因。

此外，目前市面上流行的多款NGS基因檢測產(chǎn)品還存在“設(shè)計缺陷”，即僅基于DNA進行分子檢測。基于DNA的變異檢測雖然可以滿足單核苷酸變異（SNV），插入缺失（InDEL）等變異類型的檢測需求，但對融合變異（fusion）的檢出存在缺陷。非小細(xì)胞肺癌融合基因檢測臨床實踐中國專家共識（2023版）強烈推薦，DNA 層面檢出的罕見融合伴侶、外顯子斷點融合及基因間融合應(yīng)在RNA或蛋白水平進一步驗證。推薦：DNA水平檢測驅(qū)動基因為陰性的NSCLC患者建議在RNA或蛋白水平進一步檢測基因融合。因此，對于目標(biāo)為“一網(wǎng)打盡”的NGS基因檢測產(chǎn)品，需要實現(xiàn)DNA/RNA共檢測。

DNA檢測對融合變異的檢出存在缺陷

1、PARP抑制劑伴隨診斷機會

PARP抑制劑是卵巢癌術(shù)后維持治療的首選，在乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌治療中也均有不俗的表現(xiàn)。PARP抑制劑殺傷腫瘤細(xì)胞依賴“合成致死”原理，與同源重組修復(fù)通路缺陷一起導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，對同源重組修復(fù)通路缺陷的診斷是應(yīng)用PARP抑制劑的前提。目前臨床上需要檢測的靶標(biāo)有：BRCA基因致病突變，同源重組通路基因群（HRR）致病突變，腫瘤同源重組修復(fù)通路缺陷（HRD）。包括BRCA在內(nèi)的HRR相關(guān)基因，由于基因長度大、無突變熱點，PCR和一代測序技術(shù)均難以勝任檢測，NGS可以說是目前的最佳檢測技術(shù)。此外，HRD會表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定，需要識別出在23對染色體上散在的變異特征，并用生信算法給出綜合評分從而檢測出HRD，此檢測過程更是要依賴NGS技術(shù)。

我國目前已有多款PARP抑制劑藥物獲批上市，然而遺憾的是，在PARP抑制劑伴隨診斷領(lǐng)域，目前為止僅有艾德生物的BRCA基因檢測試劑盒獲批上市，HRR、HRD檢測方面還未有檢測試劑盒獲批，PARP抑制劑伴隨診斷領(lǐng)域成為伴隨診斷企業(yè)的必爭之地。

2、潛在依賴ctDNA的多基因/多位點伴隨診斷機會

目前最熱門的依賴ctDNA的多基因多位點診斷當(dāng)屬MRD（minimal residual disease），在多種癌種中均有MRD檢測的研究，其臨床應(yīng)用價值基本確立。MRD在肺癌，結(jié)直腸癌，乳腺癌，前列腺癌等中均被證實是術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測因子，應(yīng)用前景廣闊，或可成為NGS的又一個臨床應(yīng)用機會點。

但是目前MRD的檢測仍缺乏標(biāo)準(zhǔn)，且僅在結(jié)直腸癌NCCN指南中被提及，其他癌種診療指南尚未被推薦。而且，由于早期患者ctDNA濃度低，部分患者ctDNA不入外周血，克隆性造血突變干擾等因素的影響，MRD臨床檢測困難重重，依然遠(yuǎn)未到臨床普及階段。因此，要實現(xiàn)MRD的試劑轉(zhuǎn)化，還需要解決相關(guān)技術(shù)問題，實現(xiàn)試劑轉(zhuǎn)化并注冊，解決入院困難的問題。

PART4

滿足臨床伴隨診斷檢測需求的正確思路

1、優(yōu)先滿足臨床剛需和覆蓋廣大患者群體的需求

市場上經(jīng)常會聽到或碰到一次性檢測兩三百甚至上千個基因的NGS基因檢測產(chǎn)品，這對于研究性的基因檢測分析是很有價值的。但對于臨床應(yīng)用，即便是精準(zhǔn)醫(yī)療最成熟的癌種——肺癌一線治療時，真正具有臨床指導(dǎo)價值的基因尚不超過10個，檢測成百上千的基因于患者有多少益處呢？患者需要的是針對目前已有的藥物來尋找相應(yīng)的基因檢測，優(yōu)先滿足臨床剛需和經(jīng)濟性。

在當(dāng)下醫(yī)保支出和患者總體支付能力不足的大環(huán)境下，普及度高且經(jīng)濟的PCR技術(shù)更符合需求?？上驳氖?，目前我國多地已將PCR檢測費用納入醫(yī)保報銷，讓更多患者承擔(dān)得起基因檢測，這也將提高患者群體檢測率，讓精準(zhǔn)醫(yī)療更普及。

基于NGS技術(shù)的基因檢測將成為PCR技術(shù)的補充，在后線治療或者如BRCA、HRD、MRD等復(fù)雜基因檢測中發(fā)揮作用。以日本為例，以往日本肺癌多基因檢測主要采用NGS試劑，檢測周期大約需要2-3周，自2021年日本批準(zhǔn)了來自我國企業(yè)艾德生物的PCR多基因檢測試劑上市后，因PCR不僅檢測準(zhǔn)確，而且檢測周期更短，檢測成功率更高，成功替代了當(dāng)?shù)嘏R床使用的NGS試劑，成為一、二線治療的多基因檢測首選試劑。

2、新技術(shù)不能過早應(yīng)用于臨床

基因檢測必須同時滿足“檢測方法準(zhǔn)確可靠”和“檢測結(jié)果有明確的臨床價值”這兩個條件，才能獲得法規(guī)批準(zhǔn)，合規(guī)地應(yīng)用于臨床。這是法規(guī)的要求，也是醫(yī)療安全的底線。因此，新興的NGS技術(shù)雖顯著提高了腫瘤基因檢測的通量和更多未知基因的探索能力，推動了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，比如，尋找更多的驅(qū)動基因，為科學(xué)家研發(fā)更多精準(zhǔn)治療藥物提供支撐；又比如，用于腫瘤耐藥機制等更多復(fù)雜機理的研究，從而推動腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的進步等。但是，新技術(shù)的成熟需要時間的積淀、臨床研究的驗證，在技術(shù)發(fā)展還未成熟時，過早應(yīng)用于臨床實踐弊大于利。

我們應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分患者需求和專家研究需求，不能讓患者為與其規(guī)范診療無關(guān)的研究內(nèi)容買單?，F(xiàn)階段，NGS技術(shù)復(fù)雜，成本居高不下，入院困難，醫(yī)保難覆蓋等問題仍有待解決，其應(yīng)用還是以科研和臨床轉(zhuǎn)化研究為主，只有解決了產(chǎn)品轉(zhuǎn)化問題，才能真正實現(xiàn)臨床應(yīng)用，只有守住了此原則，才能保障患者權(quán)益和醫(yī)療安全。

NGS技術(shù)是未來腫瘤基因檢測技術(shù)之一，但無論在哪個行業(yè)，其新技術(shù)商業(yè)演化的基本規(guī)律是：把更豐富的東西以更便宜的價格、用更方便的方式應(yīng)用于需求解決方案之中。就目前來看，NGS尚有諸多瓶頸還有待突破。我們相信，隨著醫(yī)學(xué)不斷發(fā)展，NGS技術(shù)必將不斷實現(xiàn)突破升級、準(zhǔn)確性不斷提高、成本不斷下降、市場行為越來越規(guī)范，那時候才是NGS真正引領(lǐng)行業(yè)發(fā)力的時代。

聲明：本文僅代表作者觀點，不代表平臺立場，如果轉(zhuǎn)載涉及版權(quán)等問題，請盡快聯(lián)系我們，我們第一時間更正或刪除，謝謝！