淋球菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法：分離培養(yǎng)

1 培養(yǎng)基 

分離淋球菌一般選用營養(yǎng)豐富的選擇性培養(yǎng)基。常用的選擇性培養(yǎng)基有改良的Thayer-Martin (T-M) 培養(yǎng)基、含抗生素的血液瓊脂或巧克力瓊脂培養(yǎng)基?？少徺I商品化的培養(yǎng)基或?qū)嶒?yàn)室自配，培養(yǎng)基應(yīng)密 封在塑料袋中，于4℃冰箱貯存，貯存時(shí)間不應(yīng)超過3周，時(shí)間過久則分離率降低。分述如下： 

1.1  Thayer-Martin(T-M)培養(yǎng)基 

1) 成分。包括 GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，血紅蛋白粉，VCNT 抑菌劑（含萬古霉素、多粘菌素、三甲氧 芐胺嘧啶和制霉菌素），Iso-Vitalex 增菌劑。 

2) 配制方法。以配制 500 mL 培養(yǎng)基為例，步驟如下： 

● 稱取 GC 瓊脂粉 18 g，置一燒瓶中，加 235 mL 蒸餾水，搖勻后置沸水浴 15 min～30 min， 使瓊脂完全溶解； 

● 稱取血紅蛋白粉 5 g，加于乳缽內(nèi)，用 250 mL 蒸餾水分次研磨溶解后，置沸水浴 15 min～ 30 min； 

● 將上述兩種溶液置于 121℃高壓滅菌 15 min，冷卻至 50℃，在無菌條件下將血紅蛋白 溶液緩慢加入到瓊脂液內(nèi)，棄去可能存在的血紅蛋白沉渣； 

● 取 1 小瓶 Iso-Vitalex 增菌劑，用所附的一小瓶稀釋液溶解后加入到步驟 3 所配的混 合液中，邊加邊搖； 

● 取一小瓶 VCNT 抑菌劑，用 5 mL 無菌蒸餾水溶解后加入到步驟 4 所配的混合液中，邊 加邊搖； 

● 在無菌條件下將配好的培養(yǎng)基分裝入無菌平皿中，待凝固后，用塑料袋封存，置 4℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2  GC 血液瓊脂培養(yǎng)基 

1) 成分。包括 GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和脫纖維羊血。 

2) 配制方法：以配制 500 mL 培養(yǎng)基為例，步驟如下： 

● 取 GC 瓊脂粉 18 g，置一燒瓶中，加 450 mL 蒸餾水，搖勻后置沸水浴 15 min～30 min， 使瓊脂完全溶解； 

● 將 GC 瓊脂溶液置于 121℃高壓滅菌 15 min，冷卻至 50℃；

● 在無菌條件下將 50 mL 脫纖維羊血（羊血在臨用前置 37℃水浴預(yù)熱）加入到瓊脂溶液 中，搖勻后分裝于無菌平皿中，待凝固后，置塑料袋封存，置 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?nbsp;

1.3 Amies運(yùn)送培養(yǎng)基(含活性炭)

1) 成分?；钚蕴?5 g，氯化鈉(NaCl)1.5 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.575 g，磷酸二氫鉀 (KH2PO4)0.1 g，氯化鉀(KCl)0.1 g，硫代乙酸鈉 0.5 g，氯化鈣(CaCl)0.05 g，氯化鎂 (MgCl)0.05 g，瓊脂 2 g，蒸餾水 500 mL。 

2) 配制方法：以配制 500 mL 培養(yǎng)基為例，步驟如下：

● 將各種成分加到 500 mL 蒸餾水中，充分混合； 

● 121℃高壓滅菌 15 min，冷卻至 50℃，然后分裝于小管中，每管 6 mL。在分裝時(shí)，不 時(shí)搖動(dòng)混勻瓊脂，以使活性炭末處于均勻混懸狀態(tài)；

● 置 2℃～8℃可儲(chǔ)存 6 個(gè)月。 

2 接種標(biāo)本

取材后標(biāo)本應(yīng)盡可能及早接種。培養(yǎng)基應(yīng)先置于室溫中預(yù)溫。將取材的拭子轉(zhuǎn)動(dòng)涂布于平皿的上1/4 范圍，然后用接種環(huán)分區(qū)劃線，以保證獲得較純的單個(gè)菌落。 

3 培養(yǎng)條件 

接種標(biāo)本后，立即將平皿置于(36±1)℃，含5％～10％ CO2，濕潤(rùn)（70％濕度）的環(huán)境中培養(yǎng)。淋 球菌為需氧菌，但初代分離需要CO2 。CO2環(huán)境可由CO2培養(yǎng)箱、CO2產(chǎn)氣袋或燭缸提供。使用燭缸時(shí)，應(yīng)使用白色、無芳香味的無毒蠟燭。在燭缸底部放些浸水棉球以保持一定的濕度。 

4 觀察結(jié)果 

培養(yǎng)24 h后檢查平皿，此時(shí)沒有菌生長(zhǎng)的平皿應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，仍無菌生長(zhǎng)才可丟棄，做出淋球菌培養(yǎng)陰性的報(bào)告。因?yàn)槟承┚辏鏏HU-營養(yǎng)型菌株生長(zhǎng)緩慢，且菌落小。如果培養(yǎng)時(shí)間不足72 h， 它們可能會(huì)被忽略。對(duì)選擇性培養(yǎng)基上分離的可疑菌落應(yīng)做進(jìn)一步鑒定。

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