流感拭子樣本采集、運輸、保存

一、流感監(jiān)測臨床標(biāo)本的采集、運送、處理及流感病毒株的運輸

01流感臨床標(biāo)本的采集

病毒分離成功與否很大程度上取決于臨床標(biāo)本的采集時間、質(zhì)量及其保存和運輸?shù)拳h(huán)節(jié)。多數(shù)標(biāo)本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物及尸檢組織。標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４妗?/p>

采樣液建議使用商品化的采樣試劑盒。也可以使用pH7.4～7.6的Hank's、Eagle's或者DMEM培養(yǎng)基自行配置。為防止采樣液生長細菌和真菌，在采樣液中可加入慶大霉素（終濃度為1mg/mL）、制霉菌素（終濃度為50U/mL）、青/鏈霉素（終濃度:青霉素G100U/mL，硫酸鏈霉素100μg/mL）。加入抗菌素以后重新調(diào)節(jié)pH值至7.4，分裝每個采樣管3mL，-20℃凍存。

常用采樣方法有以下幾種：

• 鼻咽拭子：

  將流感鼻咽拭子平行于上顎插入鼻孔，旋轉(zhuǎn)，保持?jǐn)?shù)秒，待拭子頭吸收分泌物以后，緩慢轉(zhuǎn)動退出。以另一拭子拭另側(cè)鼻孔。將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。

• 口咽拭子：

  用流感咽拭子適度用力擦拭雙側(cè)扁桃體及咽后壁，應(yīng)避免觸及舌部。將拭子頭浸入采樣液中，棄去尾部。

  注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。

• 鼻咽抽取物：

  用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用3～5mL采樣液涮洗收集器3次。

  此外，對于尸檢組織，必要時采集尸檢的肺組織標(biāo)本進行病毒分離。

02臨床標(biāo)本運輸

新鮮采集的臨床標(biāo)本應(yīng)在2-8℃條件下48h內(nèi)運送至流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室。未能48h內(nèi)送至實驗室的，應(yīng)置-70℃或以下保存。標(biāo)本送至實驗室后，應(yīng)盡快進行相應(yīng)實驗室檢測，48h內(nèi)能進行檢測的可置于4℃保存，否則建議置-70℃或以下保存。標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。運輸時在包裝箱內(nèi)填充吸水材料，并應(yīng)避免溢灑。

03臨床標(biāo)本處理

臨床采集標(biāo)本送至實驗室后，須經(jīng)處理后再進行病毒的分離接種。若為帶有聚丙烯纖維的拭子標(biāo)本，應(yīng)先將帶有聚丙烯纖維的拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。

鼻咽抽取液：用干凈滅菌的毛細吸管在無菌條件下反復(fù)吹打收集的溶液，以便打碎粘液，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上清。

組織標(biāo)本的處理：取肺組織標(biāo)本放至平皿中，用滅菌生理鹽水清洗肺組織2～3遍，研磨成組織懸液，配置成10％～20％的組織懸液，2000rpm離心10min，加入抗菌素，取上清。

注：如原始采樣液中未加入抗菌素，應(yīng)在標(biāo)本接種前補加，在采樣液中可加入慶大霉素（終濃度為1mg/mL）、制霉菌素（終濃度為50U/mL）、青/鏈霉素（終濃度:青霉素G100U/mL，硫酸鏈霉素100μg/mL）?；靹蚝笾?℃過夜或4℃作用2h后進行接種。

將處理后的臨床標(biāo)本分為三份，一份用于雞胚接種，一份用于MDCK細胞接種，一份保存待復(fù)核用。流感病毒陽性的原始標(biāo)本在-70℃至少留存6個月。病毒分離陰性的標(biāo)本隨時按生物安全的有關(guān)規(guī)定處理。

04血清標(biāo)本的采集、處理、運輸和保存

用于診斷目的的血清標(biāo)本應(yīng)該包括急性期和恢復(fù)期雙份血清。急性期血樣應(yīng)盡早采集，可在采集病毒分離標(biāo)本的同時采集，但不能晚于發(fā)病7天后?；謴?fù)期血樣則在發(fā)病后2～4周采集。為避免其他成分干擾，應(yīng)采集空腹血。

1. 建議采用商品化采血管（如BD公司，CatNo.ref357955），做好標(biāo)記，并進行登記。登記的內(nèi)容包括：醫(yī)院名稱、患者姓名、性別、急性期（Acute，A）或是恢復(fù)期（Convalescence，C）、采樣日期（年，月，日）。

2. 從患者手臂靜脈采5mL血，放入準(zhǔn)備好的上述血清管中。

3. 靜置數(shù)小時待血液完全凝固。

4. 收集血清于無菌管中，做好標(biāo)記。

5. 無菌條件下采集的血清可置4℃存放1周，非無菌條件下采集的或存放超過1周的血清需放-20℃或以下保存。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。

05流感病毒株的送檢

送國家流感中心和省級流感參比中心實驗室檢測的流感毒株，在流感監(jiān)測信息系統(tǒng)填寫“流感毒株送檢單”，在系統(tǒng)中提交送檢并打印送檢單，加蓋單位公章。低溫條件下，送至國家流感中心和省級流感參比中心實驗室進行檢測，運輸時應(yīng)遵守國家生物安全的有關(guān)規(guī)定。

流感毒株的送檢要求

各網(wǎng)絡(luò)實驗室對所有血凝滴度≥1：8的流感毒株，同時分別上送國家流感中心1管和省級流感參比中心2管，送檢量每管不低于1mL。各網(wǎng)絡(luò)實驗室分離的毒株從標(biāo)本采集到毒株送至國家流感中心的時間不超過30天。

每個開展病毒分離的網(wǎng)絡(luò)實驗室每年向國家流感中心上送不低于30株流感毒株，流感流行季節(jié)每月不少于5株。

各網(wǎng)絡(luò)實驗室對于HA陽性，但不能區(qū)分型別或亞型的毒株須在48h內(nèi)送至國家流感中心。

06標(biāo)本的接收

送檢的標(biāo)本（毒株）送到實驗室后，由專人記錄收檢日期、送檢實驗室名稱、核對并記錄送檢標(biāo)本（毒株）編號是否與送檢單相同。收到毒株后，國家流感中心和省級流感參比中心2個工作日內(nèi)在監(jiān)測信息系統(tǒng)接收。

二、流感病毒的保存及管理

01流感病毒的保存要求

1. 各個流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)實驗室寄送國家流感中心的毒株，均應(yīng)備份保存，以備復(fù)核用。

2. 對分離陽性的臨床采集的標(biāo)本，于-70℃冰箱保存6個月，以備復(fù)核用。

3. 所有陽性的流感病毒株均保存2管液體毒種，每管1mL。存放于-70℃冰箱。

4. 有條件的實驗室對HA滴度大于1:16，并且無細菌污染的毒株，應(yīng)保存2支干燥管毒種。

5. 保存管上應(yīng)注明病毒名稱、代數(shù)、保存日期。并填寫“流感毒株保存記錄表”。

6. 干燥毒株應(yīng)注明病毒名稱、代數(shù)、保存日期，并填寫“流感毒株保存記錄表”。

7. 毒株的保存需專人負責(zé)。

02毒株的管理

1. 液體毒株于-70℃或以下溫度可至少保存3年。

2. 干燥毒株可以長期保存，具體方法：等體積的病毒液與無菌脫脂奶混勻，真空冷凍干燥，置4℃或以下溫度長期保存。

3. 任何人未經(jīng)允許不得私自將毒株帶出實驗室。

4. 向其他國家和地區(qū)的實驗室提供流感毒株，需經(jīng)過相關(guān)部門審批，未經(jīng)批準(zhǔn)任何個人和單位不得私自將毒株提供給其他國家和地區(qū)。

5. 有明確的保存記錄，包括毒株保存記錄、毒株使用記錄、毒株銷毀記錄等。

6. 對于保存毒種的冰箱每日觀察工作狀況并記錄。