病毒抗原檢測(cè)法和核酸診斷方法介紹

一、抗原檢測(cè)法 

通過抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理，以病毒的特定蛋白結(jié)構(gòu)作為抗原，使用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，可確定人體或動(dòng)物體內(nèi)是否存在病毒感染。基于抗原的檢測(cè)常用方法有ELISA、免疫印跡法、免疫熒光分析以及膠體金免疫層析檢測(cè)等?？乖瓩z測(cè)法適用于病毒感染的早期診斷，可以快速獲得結(jié)果。馬家秀等開發(fā)了1種HBV核心相關(guān)抗原定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度為1.43 pg/ml，能夠較準(zhǔn)確地反映慢性乙型肝炎患者血清中的抗原水平，在輔助治療和監(jiān)測(cè)判定治療重點(diǎn)等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Wang等以水痘-帶狀皰疹病毒的糖蛋白E為目標(biāo)抗原開發(fā)了1種針對(duì)該病毒的膠體金檢測(cè)試紙，檢出下限為30 ng/ml，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本較低的優(yōu)勢(shì)，適用于大規(guī)模篩查和快速診斷。 然而，抗原檢測(cè)法的靈敏度易受到環(huán)境因素和受試者自身因素的影響，例如當(dāng)患者接種了針對(duì)相應(yīng)病原體的疫苗后，短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行抗原檢測(cè)可能造成假陽性；抗原抗體特異性結(jié)合的最適pH約為6~9，如患者在咽拭子樣本采集前食用了酸性或堿性食物則可能導(dǎo)致假陰性；當(dāng)患者自身產(chǎn)生的特異性中和抗體親和力高于檢測(cè)用抗體，同樣可能造成假陰性。

二、PCR

PCR是一種常用的病毒檢測(cè)方法，通過將病毒的DNA片段特異性擴(kuò)增，對(duì)樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來觀察擴(kuò)增結(jié)果從而判斷樣品中病毒的存在。其擴(kuò)增產(chǎn)物量以指數(shù)方式增加，經(jīng)過30~40個(gè)循環(huán)后理論上1個(gè)靶DNA分子可擴(kuò)增至10億個(gè)。由于基因的特異性，核酸檢測(cè)可以快速獲得高度準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。且可根據(jù)目的片段的長(zhǎng)度不同，在同一檢測(cè)體系內(nèi)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)病毒。門旭坤等建立了1種可以同時(shí)檢測(cè)3種導(dǎo)致豬呼吸道綜合征病毒的多重PCR方法，檢測(cè)下限約為2×105 拷貝，且特異性良好，可用于3種病毒的臨床快速檢測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查。

然而，對(duì)于PCR擴(kuò)增結(jié)果只能觀測(cè)到不同大小的DNA片段，難以進(jìn)行底物的準(zhǔn)確定量，且PCR技術(shù)需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件，包括實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、環(huán)境條件和專業(yè)的操作人員。

三、定量PCR（quantitative PCR，qPCR）

qPCR是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出來的，其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的核酸片段擴(kuò)增的實(shí)時(shí)定量。qPCR檢測(cè)熒光強(qiáng)度可直接在電腦中讀取并處理數(shù)據(jù)，比PCR簡(jiǎn)便；且相比PCR，qPCR可對(duì)病毒進(jìn)行精確定量，判斷樣品中的病毒載量。qPCR根據(jù)添加熒光物染料的原理不同，一般又可分為熒光染料法和TaqMan探針法。

SYBR Green Ⅰ染料可與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)出較強(qiáng)熒光，因此熒光強(qiáng)度與體系中擴(kuò)增片段濃度呈線性關(guān)系，可計(jì)算得到待測(cè)底物中的病毒量。陳佳圣等建立雞圓環(huán)病毒的SYBR Green ⅠqPCR檢測(cè)方法，檢出限為287 拷貝/μl，靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。此方法成本相對(duì)較低，只需要針對(duì)目的片段設(shè)計(jì)特異性的引物即可進(jìn)行檢測(cè)。由于染料與雙鏈DNA的結(jié)合是非特異性的，每次實(shí)驗(yàn)只能針對(duì)1種病毒進(jìn)行檢測(cè)，且可能出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增造成假陽性。

TaqMan探針法則是在1段與目的擴(kuò)增片段特異性結(jié)合的探針兩端分別添加熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，當(dāng)兩基團(tuán)連接在1條探針鏈上時(shí)，熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光信號(hào)。探針在擴(kuò)增過程中被Taq酶切割，使兩端基團(tuán)遠(yuǎn)離，從而能檢測(cè)到熒光信號(hào)，且熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增目的片段數(shù)量成正比。張峰等建立檢測(cè)人皰疹病毒6型、7型的單一實(shí)時(shí)qPCR方法，檢測(cè)下限達(dá)到103 拷貝，檢測(cè)靈敏度高于常規(guī)PCR方法。與熒光染料法相比，TaqMan探針法可避免非特異性擴(kuò)增的干擾，特異性更強(qiáng)；還可針對(duì)多個(gè)的目的片段分別設(shè)置攜不同熒光信號(hào)的探針，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的片段，提高檢測(cè)準(zhǔn)確性的同時(shí)還提升了檢測(cè)效率，可以對(duì)同一樣本同時(shí)檢測(cè)多種病毒。但其特異性的探針需要定制，投入成本較前者高。此外，qPCR法測(cè)得結(jié)果中包含已失活病毒顆粒的DNA含量，無法判斷病毒的感染活力。

四、反轉(zhuǎn)錄PCR（reversal transcription PCR，RT-PCR）

由于有些病毒的基因組由RNA組成，因此不能直接進(jìn)行PCR檢測(cè)，必須先將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的互補(bǔ)DNA，再進(jìn)行擴(kuò)增步驟。RT-PCR方法同樣可以結(jié)合熒光染料或探針對(duì)目的片段進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，稱為RT-qPCR，該法同樣具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。張偉等建立了1種結(jié)合熒光染料的柯薩奇病毒B組3型RT-PCR檢測(cè)法，特異性良好，檢測(cè)范圍101~109 拷貝/ml。Yan等建立了1種結(jié)合探針的多重RT-PCR技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)禽流感病毒H1、H2、H3亞型，檢測(cè)下限達(dá)到10~100 拷貝。除了用于定量病毒基因組，針對(duì)mRNA的特異性檢測(cè)還可用于測(cè)定不同時(shí)期或組織中特定基因的轉(zhuǎn)錄活躍程度，這對(duì)于探索病毒的生物學(xué)活性機(jī)制具有很大的幫助。Bartolomeo等將新型冠狀病毒接種于不同組織來源的人源細(xì)胞系，并通過RT-PCR檢測(cè)病毒入侵細(xì)胞的重要受體和輔助蛋白受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2、跨膜絲氨酸蛋白酶2的mRNA，來評(píng)估其在不同人體組織中的表達(dá)活躍程度，以探究新型冠狀病毒對(duì)人體的器官或組織嗜性。

由于RNA的單鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定易在體外分解，可能造成檢測(cè)結(jié)果偏低，因此在檢測(cè)和樣品儲(chǔ)存上對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作及環(huán)境的潔凈度有較高的要求，在一定程度上提高了成本。

作者 

曹鶴霄綜述  

李冬梅審校

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司第七研究室，200051 上海

通信作者：李冬梅

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