?流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊原材料、工藝及反應(yīng)體系的研究資料指導(dǎo)原則！

流行性感冒病毒核酸檢測試劑主要原材料研究資料、主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料指導(dǎo)原則的通知

一，主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標(biāo)準(zhǔn)品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包括：對物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

2.RT-PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

（1）脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等驗證資料。

（2）引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對序列準(zhǔn)確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等驗證資料。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。

（3）探針

特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5-端(和/或3-端)進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。純度應(yīng)達(dá)到HPLC純，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。

（4）PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗證；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

3.對照品（質(zhì)控品）的原料選擇、制備、定值過程及試驗資料。

4.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無DNase和RNase污染。

二，主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.基因位點選擇、RT-PCR方法學(xué)特性介紹。

4.確定最佳RT-PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。

5.確定RT-PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

6.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

7.不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

另外，對于試劑盒的對照（質(zhì)控）品設(shè)置，建議企業(yè)參考以下要求執(zhí)行：

（1）流感病毒核酸檢測試劑盒的外部對照（質(zhì)控）品應(yīng)至少設(shè)置臨界陽性對照（質(zhì)控）品和陰性對照（質(zhì)控）品，均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對核酸提取、RT-PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制，企業(yè)應(yīng)對各種對照（質(zhì)控）品的Ct值做出明確的范圍要求。注意，建議采用與實際檢測樣本具有相同或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對照（質(zhì)控）品，不推薦采用水作為陰性對照（質(zhì)控）品。

（2）樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性。對內(nèi)標(biāo)的Ct值也應(yīng)有明確的范圍要求。

（3）關(guān)于對照品的原料選擇：內(nèi)對照（內(nèi)標(biāo)）應(yīng)采用具有蛋白外殼的病毒顆粒，如滅活的流感病毒或缺陷病毒（假病毒）等，外部陽性對照可以采用滅活病毒、假病毒或質(zhì)粒。

表1　建議用于交叉反應(yīng)性研究的微生物

*項：選擇性驗證。

（2）干擾物質(zhì)

①潛在的干擾物質(zhì)主要包括：血液、鼻分泌物或粘液、用于緩解鼻塞和咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和過敏癥狀的藥物（見表2）。

②使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進(jìn)行驗證，另外，建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進(jìn)行評價。

③申請人應(yīng)采用每種流感病毒亞型的至少兩種病毒株對呼吸道樣本中物質(zhì)的潛在抑制影響進(jìn)行評估，建議在每種流感病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。

表2　建議用于干擾研究的物質(zhì)

4.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實驗方法可以參考相關(guān)的CLSI-EP文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗證，除申報試劑（包括提取組分和RT-PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點等要素進(jìn)行相關(guān)的驗證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進(jìn)行重復(fù)實驗以對室間精密度進(jìn)行評價。

（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括3個水平:

①陰性質(zhì)控品：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

②臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

③陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

另外，建議申請人選擇適量臨床采集的新鮮病人樣本（包括所有樣本類型）作為無靶值質(zhì)控品進(jìn)行精密度評價，以更好地模仿臨床檢測環(huán)境。

5.陽性/陰性參考品

如申報產(chǎn)品有相應(yīng)的國家參考品，則企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品應(yīng)參考國家參考品的項目設(shè)置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結(jié)合實際情況設(shè)置合理的企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產(chǎn)品，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，陽性參考品應(yīng)著重考慮病毒型別、亞型及滴度要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況。

申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進(jìn)行精確的實驗驗證，并提交詳細(xì)的驗證資料。

6.其他需注意問題

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。