熒光定量 PCR ！擴(kuò)增曲線或溶解曲線異常怎么辦？

qPCR曲線異常問題通常分為兩大類：擴(kuò)增曲線異常、融解曲線異常。

擴(kuò)增曲線異常

這個(gè)問題可能涉及到多種原因，主要可以歸結(jié)為以下 6 種：

（1）擴(kuò)增曲線不光滑

主要有兩個(gè)原因：

一是擴(kuò)增信號(hào)太弱，經(jīng)系統(tǒng)矯正后，就產(chǎn)生這樣抖啊抖的線，小編建議大家提高模板濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

二是儀器本身的問題，可能在擴(kuò)增過程中儀器出現(xiàn)了波動(dòng)或者本身該檢測孔出現(xiàn)了異常。

（2）擴(kuò)增曲線斷裂或下滑比較典型的曲線下滑如上圖所示，主要原因是模板濃度太高了，在基線期內(nèi)就起峰了，儀器會(huì)默認(rèn)起峰的線條仍為基線部分，將擴(kuò)增曲線往基線位置下拉，因此你的曲線就趴下來啦～

這種情況大家也不要慌，可以減小基線終點(diǎn)（例如基線期默認(rèn) 3 - 15 個(gè)循環(huán)，改為 3 - 10 個(gè)循環(huán)），重新分析數(shù)據(jù)，一般都能得到一個(gè)比較好的結(jié)果。

（3）個(gè)別擴(kuò)增曲線驟降

這是比較常見的一個(gè)問題，反應(yīng)管內(nèi)若留有氣泡，溫度升高后會(huì)導(dǎo)致氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低。所以大家進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)之前，一定要仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡殘留。

（4）擴(kuò)增曲線呈鋸齒狀且不連續(xù)

這個(gè)可以參考上圖，這是典型的 ROX 添加不當(dāng)導(dǎo)致的異常結(jié)果，曲線雜亂。大家首先可以嘗試去掉 ROX 分析數(shù)據(jù)，看一下重復(fù)性是否 OK（復(fù)孔間 STD<0.2），如果還是不行，只能下次實(shí)驗(yàn)的時(shí)候注意千萬不要加錯(cuò) ROX！

（5）無擴(kuò)增或 CT 值很大

檢查一下你所用的酶是否為化學(xué)修飾的熱啟動(dòng)酶，預(yù)變性時(shí)間至少 5 min，如果是高 GC 的模板，可以延長預(yù)變性時(shí)間至 10 min，預(yù)變性時(shí)間不夠，會(huì)導(dǎo)致酶活未完全釋放，酶活釋放不好，那擴(kuò)增效率肯定就不行啦，所以大家在用 qPCR 試劑的時(shí)候，一定要注意分辨熱啟動(dòng)酶的封閉手段哦～

（6）反應(yīng)結(jié)束無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)

這個(gè)問題的常見原因，主要可以歸結(jié)為以下 5 種：

反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般建議設(shè)置循環(huán)數(shù)為 40。

程序中未設(shè)置信號(hào)采集步驟：注意啦，兩步法擴(kuò)增程序一般將信號(hào)采集設(shè)置在退火延伸階段；三步法擴(kuò)增程序應(yīng)當(dāng)將信號(hào)采集設(shè)置在 72 度延伸階段。

引物降解：長時(shí)間未使用的引物應(yīng)先通過 PAGE 電泳檢測完整性，以排除引物降解的可能性。

模板濃度太低：這個(gè)大家減少稀釋度重復(fù)實(shí)驗(yàn)就可以了，一般來說，未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

模板降解：無解，請(qǐng)重新制備模板，重復(fù)實(shí)驗(yàn)吧小可憐～

溶解曲線形狀異常

（1）雜峰在主峰之前，Tm 約為 70 - 75℃——一般為引物二聚體

這種情況主要有三個(gè)解決方法：

重新設(shè)計(jì)引物；

雜峰為引物二聚體，引物二聚體主要是由于體系內(nèi)引物與引物糾纏比引物與模板結(jié)合更容易導(dǎo)致的，可以嘗試提高模板濃度、退火溫度或者降低引物濃度來進(jìn)行改善；