臨床診斷和生物研究中PCR法詳細(xì)介紹

一、歷史

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一種很普及的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和分子生物學(xué)研究。 PCR是由DNA聚合酶在體外擴(kuò)增特定的核酸（NA）序列。PCR技術(shù)的飛躍發(fā)生在1983年，當(dāng)Kary Mullis推廣使用了伴隨溫度循環(huán)的熱穩(wěn)定聚合酶。PCR的普遍應(yīng)用在于其能把數(shù)量很少的靶核酸序列，擴(kuò)增成大量的PCR產(chǎn)物，然后通過下游方法檢測，例如通過瓊脂糖凝膠電泳觀察核酸（NA）產(chǎn)物。這是由于核酸（NA）序列的指數(shù)擴(kuò)增，使得起始模板（靶核酸序列）擴(kuò)增產(chǎn)生數(shù)百萬的拷貝。

二、基本PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)擴(kuò)增靶核酸序列是通過使用DNA聚合酶，引物和核苷酸。 PCR反應(yīng)的模板可能是任何靶核酸序列，核酸的來源可能是DNA，RNA或cDNA。引物是體外合成的核酸短序列。引物的設(shè)計(jì)是互補(bǔ)結(jié)合于特定靶核酸模板的反義鏈，引物的長度通常是15-40個(gè)堿基。引物最好是缺少二級結(jié)構(gòu)并且不彼此互補(bǔ)，以防止引物二聚體的形成。多種DNA聚合酶都可用于PCR，但最廣泛使用的是耐熱的Taq DNA聚合酶。這種酶根據(jù)模板的核酸序列進(jìn)行引物延伸（在引物末端添加dNTPs或核苷酸）。

PCR反應(yīng)通常是20-40個(gè)溫度循環(huán)。核酸模板序列的變性是在95℃進(jìn)行的。引物退火結(jié)合與靶序列是在溫度冷卻至37-60℃進(jìn)行的。引物的核苷酸延伸是DNA聚合酶在60-72℃的范圍內(nèi)進(jìn)行的。常規(guī)的循環(huán)條件是起初95℃持續(xù)5分鐘，使得所有的核酸模板變性，接著是重復(fù)2-40個(gè)溫度循環(huán)（95℃持續(xù)30秒，60℃持續(xù)30秒，72℃持續(xù)1分鐘）。對于具體試驗(yàn)，在每個(gè)溫度上持續(xù)的時(shí)間可以優(yōu)化。例如，很短的靶序列的擴(kuò)增相比于很長的靶序列，在每個(gè)溫度上需要持續(xù)的時(shí)間就要短得多。每個(gè)溫度循環(huán)獲得的靶序列產(chǎn)物都是前一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物的2倍。這就導(dǎo)致了原始模板的指數(shù)擴(kuò)增，通常獲得的產(chǎn)物是原始靶核酸序列的數(shù)百萬或數(shù)十億的拷貝。

基本PCR反應(yīng)有三個(gè)時(shí)期（圖1）。指數(shù)時(shí)期是每個(gè)溫度循環(huán)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物都是確切倍增。實(shí)時(shí)PCR檢測就是在指數(shù)時(shí)期進(jìn)行的。線性時(shí)期發(fā)生的反應(yīng)減慢是由于試劑的消耗和產(chǎn)物的降解。最后時(shí)期是平臺(tái)期，就是反應(yīng)停止，不再生成擴(kuò)增產(chǎn)物了。常規(guī)PCR反應(yīng)就是在平臺(tái)期通過凝膠電泳分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

圖 1. PCR反應(yīng)的時(shí)期： 在PCR反應(yīng)過程中，在指數(shù)時(shí)期發(fā)生的是產(chǎn)物的倍增，在線性時(shí)期發(fā)生的是略低于倍增的產(chǎn)物擴(kuò)增，在平臺(tái)期發(fā)生的是非常低的幾乎停滯的產(chǎn)物擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)的下游檢測

PCR產(chǎn)物的下游檢測有許多種方法。一種常用的觀察方法是通過瓊脂糖凝膠電泳。這包括通過電泳分離核酸片段，使用嵌入染料如溴化乙錠或SybrSafe染色核酸片段，隨后使用紫外線光源和成像系統(tǒng)檢測（圖2）。

圖 2. DNA的瓊脂糖凝膠的照片： 最左邊的一行是DNA梯狀條帶，包含已知大小的核酸片段。凝膠上最下面的條帶是長度為100個(gè)堿基對的核酸片段。右面的幾行是長度為120個(gè)堿基對的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

實(shí)時(shí)PCR使用專門的熱循環(huán)儀檢測每個(gè)反應(yīng)孔的熒光信號。這個(gè)信號指示的是反應(yīng)管或反應(yīng)孔所含的雙鏈核酸的量。這個(gè)信號表示為相對熒光單位，是熱循環(huán)儀軟件相對于溫度循環(huán)周期數(shù)而繪制的（圖3）。

圖 3. 實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線： 畫圖關(guān)聯(lián)熒光信號與溫度周期數(shù)。這個(gè)信號是實(shí)時(shí)測量的，因此可以隨著PCR的進(jìn)行，實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)的進(jìn)展。

三、應(yīng)用

PCR廣泛應(yīng)用于科研，臨床和法醫(yī)領(lǐng)域。在分子生物學(xué)研究中，PCR常用于基因工程，DNA測序，基因表達(dá)分析。 在臨床實(shí)驗(yàn)室中，PCR對感染性疾病的檢測是至關(guān)重要的。在司法鑒定中，PCR的應(yīng)用包括親子鑒定和DNA指紋。這些應(yīng)用都是利用了PCR極高的敏感性，即使是來自人的一根頭發(fā)中靶核酸序列，PCR也能檢測出來。表一列出了PCR的主要應(yīng)用及其參考文獻(xiàn)。

表1：主要的PCR 應(yīng)用.

四、方法

標(biāo)準(zhǔn)/常規(guī)PCR

PCR方法有許多種，每種方法都有各自的優(yōu)點(diǎn)和局限性。標(biāo)準(zhǔn)或常規(guī)PCR是PCR反應(yīng)的最基本類型。能給出定性結(jié)果，并且需要PCR結(jié)束后的DNA檢測或觀察步驟。常規(guī)PCR的主要優(yōu)點(diǎn)是成本相當(dāng)?shù)?，并且?guī)缀跛械膶?shí)驗(yàn)室都有可用的常規(guī)PCR儀。通常情況下，常規(guī)PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過瓊脂糖凝膠電泳按照核酸片段的大小分離產(chǎn)物。 使用溴化乙錠或Sybr Safe等嵌入染料和紫外線光源觀察DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。 PCR反應(yīng)特異性的初步確定是通過產(chǎn)物的片段大小相比于DNA梯狀條帶，DNA梯狀條帶是已知大小的DNA片段的混合物。產(chǎn)物的電泳條帶可從凝膠中切割分離，條帶中的DNA通過純化和測序，從而更可靠地確定PCR反應(yīng)特異性。圖2是瓊脂糖凝膠電泳圖的一個(gè)示例，左側(cè)是DNA梯狀條帶，右側(cè)是幾個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳。標(biāo)準(zhǔn)或常規(guī)PCR的局限性是靈敏度低，并且不能給出定量結(jié)果。

表2：主要的PCR方法, 及其優(yōu)點(diǎn)和局限性

實(shí)時(shí)PCR

實(shí)時(shí)PCR是最近的，但已經(jīng)非常普遍的PCR方法，與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)PCR有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，可以實(shí)時(shí)檢測PCR產(chǎn)物，所以就不需要在PCR結(jié)束后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測DNA了。此外，實(shí)時(shí)PCR是定量的和特異的。通過與已知量的DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，可以確定樣本的靶序列起始量。PCR反應(yīng)之后，通過使用特定的核酸探針和/或熔解曲線分析，使其特異性增加。參見圖4示例的單一的PCR產(chǎn)物的熔解曲線。單峰的存在表明PCR反應(yīng)得到了單一的擴(kuò)增產(chǎn)物。多峰的存在表明PCR反應(yīng)得到了多個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，由此PCR檢測的反應(yīng)體系需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。實(shí)時(shí)PCR的局限性是成本增加，并且需要專門的熱循環(huán)儀，而且靶核酸序列起始量的定量精確度有限。

圖 4. 熔解曲線圖： 實(shí)時(shí)PCR使用DNA結(jié)合染料檢測之后，通過熔解曲線分析反應(yīng)產(chǎn)物，以確定是否生成了單一的PCR產(chǎn)物。

PCR芯片

PCR芯片是使用實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀，基于實(shí)時(shí)PCR的SYBR green檢測。 PCR芯片是在96孔板各孔中加入不同的基因特異引物，可以檢測同一樣品中多達(dá)88個(gè)基因的表達(dá)，以及8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ辗磻?yīng)。PCR芯片在96孔板的每一個(gè)孔中檢測單一基因的特定產(chǎn)物。PCR芯片通常包括對照反應(yīng)，能給出基因表達(dá)的定量結(jié)果。PCR芯片通常是用于一個(gè)特定的生物學(xué)通路（例如，DNA修復(fù)，細(xì)胞周期，或氧化應(yīng)激）的一組相關(guān)基因的表達(dá)分析。PCR芯片的優(yōu)點(diǎn)是可以同時(shí)檢測一個(gè)樣品中多個(gè)不同基因的表達(dá)。局限是每個(gè)樣品都需要分別處理，所以非常耗時(shí)，而且也很昂貴。

微流控芯片PCR

微流控芯片PCR是使用微細(xì)加工和微流體，與常規(guī)或?qū)崟r(shí)PCR相比，微流控芯片PCR可以更快速地?cái)U(kuò)增DNA。此外，微流控芯片PCR的體積小，并且集成了檢測元件，所以具有更好的便攜性和便于野外使用。數(shù)字和液滴的數(shù)字PCR能夠分隔核酸分子，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線就能定量PCR終產(chǎn)物。這樣就可以非常精確地測定拷貝數(shù)，并且能夠檢測到非常低拷貝數(shù)的目標(biāo)核酸序列。雖然微流控芯片PCR是強(qiáng)大和精確的，但是許多研究者都用不起。這是由于所需的微加工設(shè)備，或需要購買的預(yù)制芯片，是相當(dāng)昂貴的。然而，微流控芯片PCR發(fā)展迅速，成本可能很快就會(huì)顯著降低。

其他PCR方法

生物學(xué)研究還使用了許多其他PCR方法。基因分型通常使用等位基因特異的PCR。表觀遺傳學(xué)研究是主要使用甲基化特異的PCR。這種技術(shù)檢測基因組DNA中CpG島的甲基化。降落PCR（Touchdown PCR）是通過隨著反應(yīng)的進(jìn)行，逐步降低退火溫度，從而減少非特異性擴(kuò)增。這種技術(shù)有利于特定靶序列擴(kuò)增產(chǎn)量的提高。

五、PCR方法學(xué)的挑戰(zhàn)

儀器

雖然PCR是一種很普及的技術(shù)，但是仍有很多機(jī)會(huì)可以改進(jìn)，從而縮短反應(yīng)所需的時(shí)間和降低反應(yīng)液的體積。反應(yīng)速度取決于加熱和溫度循環(huán)機(jī)制的類型，以及反應(yīng)液的體積，因此是PCR改進(jìn)的首要目標(biāo)?；诮饘賶K加熱的PCR系統(tǒng)，使用間接傳導(dǎo)加熱，是很普及的，但是金屬塊的熱質(zhì)量很高，并且需要的反應(yīng)液體積比較大，所以熱變化率相當(dāng)緩慢（3oC/s）。Roche Lightcycler使用對流加熱（convective heating），并且需要的反應(yīng)液體積只有幾微升，所以溫度變化的速度很快（10oC/s） 。 微芯片PCR設(shè)備進(jìn)一步加快了反應(yīng)的速度和降低了反應(yīng)液的體積。這些芯片最常用的導(dǎo)熱原材料是硅或玻璃。這些芯片是熱電加熱，通過基于對流加熱的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)，或嵌入式電阻加熱器加熱，并且需要的反應(yīng)液體積只有幾微升。微芯片PCR還可以使用鎢絲燈的紅外線輻射直接加熱。也可以使用激光器的紅外導(dǎo)直接加熱。這兩種方法都能在幾分鐘之內(nèi)得到PCR結(jié)果，并且需要的反應(yīng)液體積只有幾皮升（picoliters）。

實(shí)驗(yàn)誤差

假陽性和假陰性PCR結(jié)果都影響PCR檢測的有效性，所以就有必要優(yōu)化PCR反應(yīng)，以防止這些假象。假陽性結(jié)果是指即使在反應(yīng)體系中沒有加入起始模板，也能檢測到DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。這可能是由于存在污染。必須在潔凈實(shí)驗(yàn)室操作，以避免氣霧化的DNA不經(jīng)意地污染反應(yīng)體系。假陰性結(jié)果是指雖然靶核酸是存在的，但是卻無法檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物。原因可能是引物的問題，或者是溫度循環(huán)參數(shù)不是最優(yōu)化的，或者是擴(kuò)增的產(chǎn)物量低于系統(tǒng)的檢測下限。為了減少假陰性的發(fā)生，就有必要對PCR檢測的體系設(shè)計(jì)和溫度循環(huán)條件進(jìn)行優(yōu)化。這包括選擇高質(zhì)量的引物，循環(huán)過程中溫度的優(yōu)化，使用高質(zhì)量的核酸模板。

六、實(shí)時(shí)PCR

優(yōu)點(diǎn)

與常規(guī)PCR相比，實(shí)時(shí)PCR有顯著的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)PCR使用檢測系統(tǒng)測量的熒光指示，通常是96孔板的封閉管中的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)時(shí)PCR不需要在PCR結(jié)束之后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，從而顯著縮短了獲得結(jié)果所需的時(shí)間。 在每個(gè)溫度循環(huán)后，檢測PCR產(chǎn)物，這樣就可以測量PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。與通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA相比，PCR產(chǎn)物的熒光檢測也更加敏感，所以靶DNA的兩倍量差異，實(shí)時(shí)PCR就能夠檢測出來，但是常規(guī)PCR和瓊脂糖凝膠就不可能檢測出來。此外，使用基于探針的實(shí)時(shí)檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測就是序列特異的。

PCR產(chǎn)物的檢測

DNA結(jié)合染料: 實(shí)時(shí)PCR采用與PCR產(chǎn)物相互作用的熒光染料或探針。熒光檢測的兩種主要類型是DNA結(jié)合染料，例如SYBR Green，或熒光標(biāo)記的序列特異探針，例如TaqMan或分子信標(biāo)探針（Molecular Beacon probes）。當(dāng)DNA結(jié)合染料結(jié)合于任何雙鏈DNA片段時(shí)，染料就發(fā)出熒光信號 。當(dāng)只有單鏈核酸存在時(shí)，這些染料就不結(jié)合于核酸，發(fā)出的熒光信號就很弱。雖然SYBR Green是最常用的，但是其他一些DNA結(jié)合染料也有使用。這些染料包括SYTO 9, SYTO-13, SYTO-82, 和 EvaGreen。因?yàn)檫@些染料的熒光信號的檢測不是序列特異的，所以就必須進(jìn)行熔解溫度分析，以確保PCR產(chǎn)物是單一的產(chǎn)物。參見圖4示例的單一的PCR產(chǎn)物的熔解曲線。如果熔解曲線有多個(gè)峰，那么就表明存在多個(gè)PCR產(chǎn)物，PCR檢測體系就需要進(jìn)一步優(yōu)化。雖然這種方法可能是耗時(shí)的，但是SYBR Green和其他DNA結(jié)合染料仍然很受歡迎，這是因?yàn)榛谌玖系臋z測方法在價(jià)格成本上明顯低于基于探針的檢測方法。

核酸酶依賴的探針: 實(shí)時(shí)PCR采用的檢測化學(xué)的第二種主要類型是序列特異性熒光標(biāo)記的探針。這些探針系統(tǒng)可以是核酸酶依賴的探針或者是簡單的雜交探針。核酸酶切割的探針包括TaqMan, HybProbe（兩種寡核苷酸），小溝結(jié)合（MGB）探針，鎖核酸（LNA）探針。這些探針與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的目標(biāo)核酸序列互補(bǔ)結(jié)合，探針的兩端分別共價(jià)連接一個(gè)報(bào)告熒光染料和一個(gè)淬滅熒光染料。這些系統(tǒng)使用的是螢光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)。當(dāng)染料彼此接近的時(shí)候，報(bào)告染料的熒光信號被淬滅，因此就檢測不到任何信號了。然而，當(dāng)染料彼此分開的時(shí)候，報(bào)告染料的熒光不被淬滅，因此就能檢測到信號。探針退火結(jié)合的序列是在PCR引物的結(jié)合位點(diǎn)中，Taq DNA聚合酶在延伸引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的同時(shí)，其5'外切酶活性把探針的末端切除。淬滅染料被切除之后，報(bào)告染料就能在激發(fā)下，產(chǎn)生熒光信號。循環(huán)探測技術(shù)（CPT）的探針包含RNA核苷酸，所以不同于TaqMan類型的探針。CPT探針雜交于靶序列之后形成RNA-DNA雙鏈。 然后用RNaseH酶把探針的淬滅染料切除。

雜交探針: 雖然雜交探針也是序列特異的，但是不需要核酸外切酶把雜交探針的染料切除。雜交探針包括分子信標(biāo)（Molecular Beacons），在兩個(gè)反向重復(fù)序列之間有一個(gè)單環(huán)區(qū)域，形成了一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。探針變性，然后退火結(jié)合到目標(biāo)序列，發(fā)夾就被打開了，熒光染料彼此分開，足以使得報(bào)告染料生成增強(qiáng)的熒光信號。其他檢測探針技術(shù)，包括Scorpion（探針和引物合并在一個(gè)分子上），LUX （Light Upon eXtension）檢測。 Lux 引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)淬滅了 Lux 引物探針3'端的熒光染料信號。一旦引物結(jié)合到靶序列，隨著DNA聚合酶延伸引物序列，染料的熒光信號就增強(qiáng)了。

實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果分析

實(shí)時(shí)PCR熱循環(huán)儀系統(tǒng)檢測的熒光強(qiáng)度，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的積累是成正比的。然而，結(jié)果分析只限于實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)指數(shù)時(shí)期的數(shù)據(jù)，因?yàn)檫@是精確定量的最佳數(shù)據(jù)點(diǎn)。閾值循環(huán)數(shù)（CT）是實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)管中的熒光強(qiáng)度超過閾值時(shí)溫度循環(huán)的周期數(shù)，熒光強(qiáng)度的閾值是設(shè)定在基線以上，但是在擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期之內(nèi)。實(shí)時(shí)PCR一般采用兩種定量測定方法。相對定量是把試驗(yàn)處理的樣本與對照的樣本相比較，比照標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參基因表達(dá)量，確定靶序列基因表達(dá)量的相對比例。關(guān)鍵是試驗(yàn)處理方法不會(huì)對使用的內(nèi)參基因的表達(dá)量造成影響。相對定量的主要優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)椴恍枰⑿?zhǔn)曲線，所以縮短了檢測時(shí)間。常用的方法包括相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法，以及比較CT法（ΔΔCT）。后者的數(shù)學(xué)模型計(jì)算參見 Pfaffl。

絕對定量是通過把樣品的擴(kuò)增信號對比于靶DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測樣品中靶序列的實(shí)際的起始量。校準(zhǔn)曲線可以是基于核酸分子（可以是重組質(zhì)粒DNA其中插入了亞克隆擴(kuò)增序列，實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物，或合成的大片段寡核苷酸）的稀釋，。質(zhì)粒DNA被廣泛使用，是因?yàn)樗姆€(wěn)定性高于PCR產(chǎn)物或寡核苷酸。然而，較短模板的準(zhǔn)備所需的時(shí)間也較短。通過對已知濃度的質(zhì)粒（插入了亞克隆擴(kuò)增序列）進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，得到質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，畫圖關(guān)聯(lián)CT值與靶序列起始拷貝數(shù)的對數(shù)（圖5）。 CT值與起始拷貝數(shù)的對數(shù)是成反比的。通過對標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸，確定試驗(yàn)樣品的靶序列起始拷貝數(shù)。

圖 5. 質(zhì)粒DNA的實(shí)時(shí)PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線： 質(zhì)粒pGEMT重組克隆靶基因的擴(kuò)增序列。經(jīng)DNA測序證實(shí)靶基因擴(kuò)增序列的存在。一式三份地稀釋質(zhì)粒，畫圖關(guān)聯(lián)PCR反應(yīng)的閾值循環(huán)（CT）與質(zhì)粒DNA已知的起始量。

七、微流控芯片

自1990年以來，對PCR反應(yīng)和熱循環(huán)儀的微型化創(chuàng)新，體現(xiàn)在微流控芯片PCR。例如，在1998年，Northrup et. al報(bào)道了他們創(chuàng)建的一個(gè)微型分析熱循環(huán)儀（MATCI），是硅材料的并且反應(yīng)孔集成了加熱器。MATCI儀在PCR循環(huán)進(jìn)行的同時(shí)實(shí)時(shí)檢測熒光信號，儀器在便攜性上等同于公文包。此后，微流控芯片PCR領(lǐng)域開始了騰飛，技術(shù)進(jìn)步包括多種加工材料和構(gòu)造。

大多數(shù)PCR芯片的反應(yīng)腔是硅材料的。硅具有優(yōu)異的導(dǎo)熱性，在溫度循環(huán)過程中可以實(shí)現(xiàn)快速溫度變化。然而，芯片材料也可以是玻璃，聚合物包括聚碳酸酯和聚二甲基硅氧烷，陶瓷，317不銹鋼。芯片構(gòu)造可以是基于靜態(tài)固定反應(yīng)腔，也可以是基于動(dòng)態(tài)連續(xù)流動(dòng)的。固定反應(yīng)腔的芯片，PCR反應(yīng)液是靜態(tài)的，反應(yīng)腔進(jìn)行溫度循環(huán)。這些芯片可能是單腔或多腔。動(dòng)態(tài)連續(xù)流動(dòng)的芯片，在PCR擴(kuò)增的溫度循環(huán)過程中，樣品被泵驅(qū)動(dòng)通過微通道。這些芯片的樣品流速?zèng)Q定了溫度轉(zhuǎn)換的時(shí)間。 微芯片PCR縮短了檢測時(shí)間，試劑消耗低，加熱和冷卻的溫度循環(huán)速度快，并且降低了耗電量。 微芯片PCR可能需要下游處理檢測DNA，例如瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管電泳。然而，在芯片上也可能包括DNA檢測方法，例如毛細(xì)管電泳，熒光檢測或DNA雜交方法。 微芯片PCR技術(shù)還在繼續(xù)發(fā)展，包括芯片檢測系統(tǒng)的集成，以及加工材料和溫度循環(huán)方法的優(yōu)化。

八、數(shù)字和液滴的數(shù)字PCR

基于微流控腔的數(shù)字PCR（cdPCR）方法無需使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，就能夠進(jìn)行核酸的絕對定量。數(shù)字cdPCR是樣品被分隔成離散的油包水液滴，液滴中可能沒有任何的靶核酸，或可能有一個(gè)或多個(gè)拷貝的靶核酸序列。 在PCR擴(kuò)增之后，檢測靶序列的存在，通過計(jì)數(shù)陽性液滴在液滴總數(shù)中所占的比例，進(jìn)行濃度計(jì)算。 “液滴”數(shù)字PCR是最尖端的數(shù)字PCR方法?！耙旱巍睌?shù)字PCR的液滴分隔數(shù)目是數(shù)字PCR的25倍，可以非常精確地估算靶序列的拷貝數(shù)。

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