呼吸道感染病原體檢測(cè)技術(shù)與發(fā)展趨勢(shì)

作者簡(jiǎn)介

余方友，醫(yī)學(xué)博士，教授，博/碩士研究生導(dǎo)師，現(xiàn)任同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科主任，擔(dān)任中國(guó)醫(yī)促會(huì)臨床微生物學(xué)與感染分會(huì)常委，中國(guó)防癆協(xié)會(huì)結(jié)核病基礎(chǔ)分會(huì)副主任委員，中國(guó)防癆協(xié)會(huì)人獸共患結(jié)核病分會(huì)副主任委員。主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制方面的研究，曾先后主持課題18項(xiàng)，并于2009年、2012年、2014年、2016年、2018年、2020年和2022年先后7次獲得國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目。以通信作者或第一作者發(fā)表論文180余篇，其中SCI收錄論文80余篇。曾獲得中華醫(yī)學(xué)科技獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)和浙江省科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)各1次，其他廳市級(jí)科技獎(jiǎng)7次。

【摘要】由于傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測(cè)手段的限制，導(dǎo)致臨床診斷難、治療用藥難。呼吸道感染多聯(lián)檢產(chǎn)品時(shí)效性高，可及早識(shí)別感染，并指導(dǎo)抗感染藥物的合理使用。各種便攜式（快速）診斷技術(shù)產(chǎn)品發(fā)展迅速，臨床應(yīng)用前景廣闊。宏基因組二代測(cè)序技術(shù)（mNGS）對(duì)呼吸道感染病原體的檢測(cè)覆蓋面廣、信息量大，對(duì)呼吸道病原體的早期發(fā)現(xiàn)，特別是新發(fā)傳染病的病原體快速診斷，起到非常重要的作用。基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（CRISPR）的核酸檢測(cè)技術(shù)、三代測(cè)序技術(shù)及基因芯片技術(shù)等快速檢測(cè)新技術(shù)為呼吸道病原體的診斷開辟了新的方向。

【關(guān)鍵詞】 呼吸道病原體；宏基因組二代測(cè)序技術(shù)；規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列/規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白檢測(cè)技術(shù)；三代測(cè)序技術(shù)；基因芯片

呼吸道感染是指由多種病原微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、寄生蟲等引起的感染性疾病。呼吸道感染分為上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸道感染主要由病毒引起，占70%～80%，包括鼻病毒、冠狀病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、?？刹《尽⒖滤_奇病毒等。上呼吸道感染一般起病急、病程短，通常自限且預(yù)后良好。下呼吸道感染包括社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia,CAP)、醫(yī)院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP)、支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎和氣管炎，病原體主要為細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒。下呼吸道感染多表現(xiàn)為重癥，死亡率高、預(yù)后差。2019年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)公布的全球主要死亡原因中就包括了呼吸道感染，下呼吸道感染仍然是世界上病死率最高的感染性疾病之一，排在主要死亡原因的第四位［1］。美國(guó)的一項(xiàng)研究表明，盡管進(jìn)行了全面的診斷工作，但高達(dá)62%的CAP的病因仍未得到明確［2］。在沒有明確的病原微生物學(xué)診斷情況下，對(duì)嚴(yán)重的下呼吸道感染患者通常在最初的治療中會(huì)使用經(jīng)驗(yàn)性的廣譜抗菌藥物來緩解癥狀。一旦確定病原體，臨床醫(yī)師應(yīng)調(diào)整或停止這種經(jīng)驗(yàn)性治療［3-4］。但是，在患者反應(yīng)良好或沒有檢測(cè)到導(dǎo)致感染的病原體時(shí)，臨床醫(yī)師則通常會(huì)繼續(xù)進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性治療，最終導(dǎo)致廣譜抗菌藥物的濫用。此外，在沒有微生物病原學(xué)檢查的情況下，臨床醫(yī)師可能會(huì)錯(cuò)誤地將癥狀歸類為非感染性炎癥反應(yīng)，并經(jīng)驗(yàn)性使用激素類藥物治療，這可能會(huì)導(dǎo)致再次感染［5］。在我國(guó)，與醫(yī)院相關(guān)的感染中，呼吸道感染，特別是下呼吸道感染是院內(nèi)感染的主要類型［6］。因此，快速、準(zhǔn)確地識(shí)別病原體可以進(jìn)行精準(zhǔn)治療，減少?gòu)V譜抗菌藥物的濫用和院內(nèi)感染的傳播，并促進(jìn)患者康復(fù)。

1 傳統(tǒng)的檢測(cè)方法

病原體的培養(yǎng)作為呼吸道病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性高、成本低，但對(duì)于一些難以培養(yǎng)的病原體(如病毒、衣原體)來說，時(shí)效性和敏感性較差［7］。因此這些病原體的分離培養(yǎng)不適用于常規(guī)檢測(cè)。涂片檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是快速、直觀、成本低，臨床易于開展，但缺點(diǎn)是敏感性偏低，并且非常依賴于檢驗(yàn)工作人員的經(jīng)驗(yàn)。免疫學(xué)檢測(cè)是通過血清學(xué)來檢測(cè)抗原和（或）抗體的檢測(cè)方法。在疾病早期，抗原檢測(cè)的診斷價(jià)值較好，可以通過直接免疫熒光法或間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay, IFA）、免疫層析法檢測(cè)病原體的抗原蛋白。病原體抗原檢測(cè)的特異性強(qiáng)，但敏感性偏低。在疾病的中后期，隨著特異性抗體［免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）和免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）］的產(chǎn)生，抗體的檢測(cè)為疾病的發(fā)展和預(yù)后提供了重要的線索。臨床上已開展9項(xiàng)呼吸道病原體抗體聯(lián)檢項(xiàng)目，其原理是用IFA檢測(cè)9種呼吸道感染常見病原體的IgM抗體，包括嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒。免疫學(xué)檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、成本低，缺點(diǎn)是敏感性低、易漏檢，存在窗口期。

2 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)可快速、準(zhǔn)確地識(shí)別病原體并及時(shí)診斷感染性疾病，與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、涂片檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)等方法學(xué)相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于難以分離培養(yǎng)的病毒，可以培養(yǎng)但是生長(zhǎng)緩慢的結(jié)核分枝桿菌、軍團(tuán)菌以及一些不能常規(guī)培養(yǎng)的呼吸道病原體來說，分子生物學(xué)技術(shù)具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)?；诰酆厦告湻磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的核酸檢測(cè)方法多樣，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR法因其可靠性和重復(fù)性好，已廣泛用于流感、結(jié)核病等呼吸系統(tǒng)疾病的診斷。此外，基于等溫?cái)U(kuò)增的快速核酸檢測(cè)技術(shù)以及可以同時(shí)檢測(cè)所有病原體的宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)近年來發(fā)展迅速，革新了呼吸道感染病原體的檢測(cè)時(shí)代。由于臨床對(duì)核酸檢測(cè)的要求越來越高，即快速（越快越好）、現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)（point-of-care testing，POCT）和便攜式，近年來一些便攜式（快速）微生物分子診斷技術(shù)和平臺(tái)發(fā)展迅速。目前，便攜式（快速）分子診斷產(chǎn)品已應(yīng)用于病毒檢測(cè)，包括呼吸道病毒［流感病毒A/B、呼吸道合胞病毒、新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）］及人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)等；同時(shí)也應(yīng)用于細(xì)菌及耐藥性檢測(cè)方面，包括結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥、常見多重耐藥菌、胃腸道病原體A/B群鏈球菌等。便攜式（快速）分子診斷儀器在呼吸道感染病原體中的應(yīng)用介紹如下。

2.1　基于單個(gè)靶標(biāo)的分子檢測(cè)平臺(tái)　

首先介紹的是基于GeneXpert快速分子檢測(cè)平臺(tái)。GeneXpert MTB/RIF是WHO于2010年批準(zhǔn)并推薦的一種用于快速診斷結(jié)核病和利福平耐藥性的分子檢測(cè)方法［8］。然而GeneXpert需要實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施，包括電力供應(yīng)，因此不能用于床旁檢測(cè)。GeneXpert Edge/Omni是新一代的檢測(cè)平臺(tái)，可用于床旁檢測(cè)，旨在供基礎(chǔ)設(shè)施有限的醫(yī)療服務(wù)中心使用。GeneXpert Edge/Omni的特點(diǎn)是單模塊設(shè)計(jì)、觸摸平板操作、體積小、重量輕、電池供電，單個(gè)樣本檢測(cè)只需80 min。GeneXpert平臺(tái)不僅可以檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，還可以檢測(cè)艱難梭菌、HIV、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒等［9］。羅氏的Cobas Liat平臺(tái)基于實(shí)時(shí)PCR以及實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)DNA或RNA靶標(biāo)，使用特殊的氣壓微流控芯片結(jié)構(gòu)，通過空間溫控大大加快PCR擴(kuò)增過程，檢測(cè)時(shí)間僅為15～20 min。Cobas Liat平臺(tái)可用于A群鏈球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的快速檢測(cè)。盡管在一些技術(shù)方面和可移動(dòng)性上存在一些限制，但Cobas Liat仍是得到廣泛驗(yàn)證的便攜式分子儀器［9］。還有雅培的ID Now平臺(tái)，與羅氏的Cobas Liat平臺(tái)相似，早期也是用于流感的檢測(cè)，也可以同時(shí)檢測(cè)呼吸道合胞病毒和A群鏈球菌。其原理基于Nicking酶擴(kuò)增反應(yīng)技術(shù)和恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，不需要復(fù)雜的熱循環(huán)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，可在很窄的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行靶標(biāo)的迅速放大，檢測(cè)時(shí)間僅需5～13 min。ID Now平臺(tái)重量輕，體積小，便于攜帶，適用于診所、醫(yī)院急診等多種醫(yī)療場(chǎng)景［10］。POCT快速分子檢測(cè)平臺(tái)在減少流感的院內(nèi)傳播中起到了很大的作用［11］。同樣，在當(dāng)前全球新型冠狀病毒肺炎（簡(jiǎn)稱新冠肺炎）疫情的背景下，一些快速的檢測(cè)平臺(tái)在疫情防控中也發(fā)揮了巨大的作用。出于對(duì)疫情防控的要求，多個(gè)快速核酸檢測(cè)試劑盒通過國(guó)家應(yīng)急審批，極大推動(dòng)了國(guó)內(nèi)分子診斷POCT的開發(fā)及應(yīng)用［12］。如優(yōu)思達(dá)Easy NET平臺(tái)，最初主要用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，在新冠肺炎疫情發(fā)生以來，該平臺(tái)增加了SARS-CoV-2的檢測(cè)功能。采用獨(dú)特的交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光技術(shù)，檢測(cè)時(shí)間為80～90 min。另外還有圣湘iPonatic平臺(tái)、遂真LifeReady 1000系統(tǒng)等，均可用于SARS-CoV-2的快速檢測(cè)，并已在多個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床比對(duì)驗(yàn)證并投入使用。

2.2　呼吸道感染多靶標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)　

多靶標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)可以聯(lián)合檢測(cè)多項(xiàng)呼吸道病原體，從而提升呼吸道病原精準(zhǔn)鑒別，優(yōu)化和改進(jìn)感染性疾病的精準(zhǔn)治療。臨床上已注冊(cè)的聯(lián)合檢測(cè)試劑盒有呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒、六項(xiàng)呼吸道病原體核酸檢測(cè)試劑盒、七項(xiàng)呼吸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒、三項(xiàng)呼吸道病毒核酸檢測(cè)試劑盒、13種呼吸道病原體多重檢測(cè)等。FilmArray系統(tǒng)是生物梅里埃公司旗下Biofire公司的旗艦產(chǎn)品，與GeneXpert類似，F(xiàn)ilmArray多重PCR系統(tǒng)也集樣品制備、擴(kuò)增、檢測(cè)和分析功能于一體，F(xiàn)ilmArray檢測(cè)系統(tǒng)是真正的POCT產(chǎn)品，并且是美國(guó)食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的呼吸道病原體的多重檢測(cè)系統(tǒng)。FilmArray檢測(cè)系統(tǒng)可以同時(shí)檢測(cè)引發(fā)呼吸道感染的20余種病原靶標(biāo)，包括冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、鼻病毒、百日咳桿菌、肺炎衣原體、肺炎支原體等，為準(zhǔn)確判斷疾病和及時(shí)控制疫情爭(zhēng)取了時(shí)間［13］。另外一款FDA批準(zhǔn)的呼吸道病原體的多重檢測(cè)系統(tǒng)是eSensor RVP呼吸道病毒檢測(cè)系統(tǒng)，可檢測(cè)甲型流感病毒的不同亞型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒、鼻病毒、腺病毒等14個(gè)靶標(biāo)［14］。而GenMark公司的ePlex RPP呼吸道病毒檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)的病毒靶標(biāo)與eSensor RVP檢測(cè)系統(tǒng)相似，可以檢測(cè)包括肺炎衣原體、肺炎支原體在內(nèi)的17個(gè)病原體靶標(biāo)［15］。2020年GenMark公司推出了RP2 Panel（The ePlex SARS-CoV-2 Test），增加了檢測(cè)靶標(biāo)“SARS-CoV-2”。雖未獲FDA批準(zhǔn)，但FDA授權(quán)其可用于緊急使用。VERIGENE系統(tǒng)通過PCR擴(kuò)增結(jié)合納米金顆粒標(biāo)記的探針，與排列在載玻片上的寡核苷酸靶序列進(jìn)行雜交。探針捕獲目標(biāo)片段后，信號(hào)隨即放大，從而可用于超靈敏的DNA檢測(cè)。該系統(tǒng)已開發(fā)出用于檢測(cè)13種病毒和3種細(xì)菌靶標(biāo)的多重呼吸道檢測(cè)組合且正在申請(qǐng)F(tuán)DA的認(rèn)證。現(xiàn)有的便攜式診斷技術(shù)產(chǎn)品各自具有不同的優(yōu)點(diǎn)和不足，或注重可移動(dòng)性和環(huán)境適應(yīng)性，或強(qiáng)調(diào)快速、短時(shí)間獲得結(jié)果，或側(cè)重高通量多靶標(biāo)檢測(cè)。不同特性的產(chǎn)品適合不同的場(chǎng)景。然而需要意識(shí)到，在成本控制和質(zhì)量控制方面仍存在諸多挑戰(zhàn)，未來需要更多的性能驗(yàn)證、臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)以及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)估，支持便攜式分子診斷技術(shù)產(chǎn)品性能的持續(xù)創(chuàng)新和持續(xù)優(yōu)化。

3 呼吸道傳染病病原體快速檢測(cè)新技術(shù)

3.1　mNGS　

mNGS能夠不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，無偏倚性提取標(biāo)本中全部的核酸進(jìn)行高通量測(cè)序，通過生物信息分析，去除人源序列后，其余序列與病原數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得疑似致病微生物的種屬信息，因而在急危重癥、疑難及混合感染診斷方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)［16］。近年來，在呼吸系統(tǒng)感染診斷方面，mNGS愈加廣泛地應(yīng)用于病原體物種的鑒定、呼吸道微生物群分析、人類宿主反應(yīng)分析、耐藥基因研究等［17］。mNGS對(duì)呼吸道感染病原體的檢測(cè)覆蓋面廣、信息量大，對(duì)呼吸道病原體的早期發(fā)現(xiàn)，特別是新發(fā)傳染病病原體的快速診斷中，起到非常重要的作用，如對(duì)SARS-CoV-2的認(rèn)知和檢測(cè)［18］。支氣管肺泡灌洗液樣本的mNGS可為肺部感染提供更準(zhǔn)確的診斷信息，并顯示不同基礎(chǔ)疾病中呼吸道微生物群的變化［19］。mNGS具有準(zhǔn)確性和可靠性高、可提供大量的生物信息、對(duì)未知病原確認(rèn)快、周轉(zhuǎn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因此，mNGS是解決呼吸道感染問題的重要手段，在臨床實(shí)踐中被廣泛接受［20］。但是由于mNGS檢測(cè)費(fèi)用高、人類及外源微生物核酸序列的干擾以及潛在的新耐藥基因或突變，故不能取代表型藥敏試驗(yàn)。此外，高通量測(cè)序結(jié)果的分析至關(guān)重要，雖然國(guó)內(nèi)已有mNGS用于檢測(cè)呼吸道病原體的專家共識(shí)［21］，但mNGS結(jié)果與臨床相關(guān)性的解釋仍然是難點(diǎn)。mNGS往往檢出多種微生物，如何判斷病原菌與定植菌以及是否為混合感染，需要結(jié)合mNGS參數(shù)、臨床表現(xiàn)、炎癥指標(biāo)、微生物特點(diǎn)、常規(guī)培養(yǎng)等綜合考慮。

3.2　基于規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）的核酸檢測(cè)技術(shù)　

CRISPR/CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR associated protein，Cas）能夠識(shí)別高度特異的核酸序列，通過聯(lián)合高靈敏小型生物傳感器運(yùn)用于感染性疾病中?；贑RISPR/Cas技術(shù)發(fā)展的分子檢測(cè)方法具有快速、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，在病原體檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速。目前用于呼吸道病原體檢測(cè)的主要有CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13等系統(tǒng)。張鋒團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于CRISPR/Cas13的SHERLOCK技術(shù)，為SARS-CoV-2提供了快速準(zhǔn)確的診斷方法［22］。其原理是當(dāng)Cas13酶與設(shè)計(jì)合成的SARS-CoV-2靶病毒RNA結(jié)合時(shí)，Cas13酶激活RNA酶切割活性，導(dǎo)致RNA傳感器降解，并產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而能夠檢測(cè)到該病毒。該技術(shù)最后需要將試紙條浸入反應(yīng)體系中，通過辨識(shí)條帶位置的不同來確認(rèn)是否感染SARS-CoV-2［23］。另外，一項(xiàng)包括肺結(jié)核病和肺外結(jié)核病病例的隊(duì)列研究顯示，在結(jié)核病診斷應(yīng)用中，CRISPR-MTB檢測(cè)比培養(yǎng)和GeneXpert MTB/RIF具有更好的診斷性能，成為一種新的肺結(jié)核病和肺外結(jié)核病診斷技術(shù)［24］。CRISPR的核酸檢測(cè)技術(shù)的缺點(diǎn)包括：（1）離子水平、溫度、pH值等諸多因素可能會(huì)干擾系統(tǒng)中Cas效應(yīng)蛋白的切割活性，影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性；（2）難以進(jìn)行病原體的核酸定量分析，適合病原體的核酸定性分析；（3）采集信號(hào)的方法受限，且多個(gè)檢測(cè)步驟之間可能存在互相干擾和交叉反應(yīng)；（4）受到待測(cè)樣本中病原體靶標(biāo)濃度的限制，通常CRISPR檢測(cè)方法仍需結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)。

3.3　三代測(cè)序技術(shù)［基于納米孔（nanopore）］　

又稱納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，核心就是利用一個(gè)納米孔，孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭，將納米孔蛋白固定在電阻膜上后，再利用動(dòng)力蛋白牽引核酸穿過納米孔。由于納米孔的直徑非常細(xì)小，僅允許單個(gè)堿基通過。4種堿基（A/T/C/G）帶電性質(zhì)不一樣，因此不同堿基通過蛋白納米孔時(shí)對(duì)電流產(chǎn)生的干擾不同，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并解碼這些電流信號(hào)便可確定堿基序列，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)序［25］。納米孔測(cè)序技術(shù)可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌性下呼吸道感染的快速臨床診斷，在6 h內(nèi)即可鑒定出病原菌和耐藥基因，有助于減少?gòu)V譜抗生素的使用［26］。納米孔測(cè)序還可以同時(shí)檢測(cè)甲型流感和其他呼吸道病毒，識(shí)別耐藥突變、表征遺傳多樣性以及發(fā)現(xiàn)潛在的院內(nèi)傳播事件［27］。英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technology，ONT）的Minion測(cè)序儀依靠使用納米孔進(jìn)行測(cè)序，是一種手持便攜式設(shè)備，無需ONT技術(shù)人員即可在任何地方安裝。因此，Minion手持測(cè)序儀是一種有吸引力的快速和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的替代技術(shù)。此外，ARTIC與ONT公司攜手合作，利用納米孔實(shí)時(shí)傳遞數(shù)據(jù)的優(yōu)勢(shì)，共同開發(fā)出8 h端到端的快速工作流，利用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)包括埃博拉、流感和SARS-CoV-2在內(nèi)的RNA病毒進(jìn)行測(cè)序［28］。該技術(shù)的缺點(diǎn)是存在等位基因變異體難以區(qū)分、基因型與表型不一致等弊端，正在研發(fā)和完善中。

3.4　基因芯片技術(shù)　

又稱DNA微陣列，基因芯片技術(shù)的核心是雜交測(cè)序，原理是將一組已知序列的核酸探針固定于基質(zhì)材料（如玻片、硅片、尼龍膜、微型磁珠等），然后與待分析標(biāo)記的樣品雜交，標(biāo)記的樣品通過與基因芯片上已知堿基序列的核酸片段互補(bǔ)雜交，通過分析熒光強(qiáng)度從而得到樣品的遺傳信息，確定樣品的核酸序列，或?qū)虮磉_(dá)量及其特性進(jìn)行分析?；蛐酒夹g(shù)是多種學(xué)科交叉的產(chǎn)物，是生物芯片的一種，也是生物芯片技術(shù)中發(fā)展最成熟、最先進(jìn)入應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)商品化的技術(shù)。一項(xiàng)基因芯片技術(shù)在基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模評(píng)估研究表明，基因芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥和異煙肼耐藥具有較高的敏感性和特異性。筆者推薦在實(shí)驗(yàn)室條件允許的情況下，基因芯片技術(shù)可作為利福平和異煙肼常規(guī)傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一種更有效、快速、安全和經(jīng)濟(jì)的替代方法，是一種值得在我國(guó)基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用的方法［29］。傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)存在檢測(cè)靈敏度低、操作步驟繁瑣、易污染等缺點(diǎn)，我國(guó)研究者研制出了一種新的納米金復(fù)合底物Nanogold-DAB，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）能夠直接催化此復(fù)合底物反應(yīng)導(dǎo)致大量納米金顆粒特異沉積，從而建立了一種基于生物芯片的納米金復(fù)合底物的高靈敏、可視化檢測(cè)方法。同時(shí)，創(chuàng)新設(shè)計(jì)全封閉防污染芯片結(jié)構(gòu)，成功研制了全新的自動(dòng)化生物芯片檢測(cè)儀，實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增、雜交、檢測(cè)和分析一體化。基于可視化生物芯片技術(shù)研制的流感病毒分型基因芯片獲得了首個(gè)可視化生物芯片產(chǎn)品的注冊(cè)證書。此外，有研究展示了一種全印刷納米光子生物芯片，該技術(shù)結(jié)合集成芯片和光子晶體納米結(jié)構(gòu)增強(qiáng)熒光的特點(diǎn)，可以在10 min內(nèi)對(duì)SARS-CoV-2的N蛋白進(jìn)行快速床旁檢測(cè)。隨著納米光子結(jié)構(gòu)和理論的進(jìn)一步探索，以及印刷技術(shù)的不斷改進(jìn)，納米光子生物芯片將發(fā)展成為一種便攜式、低成本、高效的檢測(cè)方法，用于微量樣品中生物標(biāo)志物的POCT檢測(cè)［30］。

4 總結(jié)與展望

傳統(tǒng)呼吸道病原體檢測(cè)手段如培養(yǎng)、涂片因敏感性和時(shí)效性差，常導(dǎo)致臨床診斷和治療用藥難。呼吸道感染多聯(lián)檢產(chǎn)品時(shí)效性高，可及早識(shí)別感染，并指導(dǎo)抗感染藥物的合理使用。各種便攜式（快速）診斷技術(shù)產(chǎn)品發(fā)展迅速，臨床應(yīng)用前景廣闊，適用于診所、醫(yī)院急診等多種醫(yī)療場(chǎng)所，但是仍需進(jìn)行一系列的性能驗(yàn)證、臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)以及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)評(píng)估。mNGS對(duì)呼吸道感染病原體的檢測(cè)覆蓋面廣、信息量大，已廣泛應(yīng)用于臨床。mNGS對(duì)呼吸道病原體的早期發(fā)現(xiàn)，特別是新發(fā)傳染病的病原體快速診斷以及急危重癥、疑難及混合感染診斷方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但mNGS的測(cè)序結(jié)果與臨床相關(guān)性的解釋仍然是難點(diǎn)。在未來，一些新的快速檢測(cè)技術(shù)，如基于CRISPR的核酸檢測(cè)技術(shù)、三代測(cè)序技術(shù)及基因芯片技術(shù)是趨勢(shì)，也是挑戰(zhàn)。只有將傳統(tǒng)的培養(yǎng)、涂片等方法與各種分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才能優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，從而達(dá)到快速而準(zhǔn)確地識(shí)別呼吸道病原體的臨床目標(biāo)。

引用本文：陳舒影，余方友. 呼吸道感染病原體檢測(cè)技術(shù)與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)臨床新醫(yī)學(xué), 2022,15(10): 894-899.