基于細(xì)胞外囊泡的體外診斷技術(shù)：目前現(xiàn)狀和未來方向

細(xì)胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)作為親代細(xì)胞的“指紋”，能夠?qū)崟r揭示親代細(xì)胞的代謝、增殖、遷移等信息，為癌癥檢測中的早期診斷、分型、預(yù)后、伴隨診斷、動態(tài)監(jiān)測等提供有力工具。這篇綜述概括了目前從體液中分離EVs的方法以及分析EVs中生物標(biāo)志物分子(包括蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等)的技術(shù)進(jìn)展，并討論了基于EVs的體外診斷在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢、可行性和面臨的挑戰(zhàn)。

EVs是細(xì)胞釋放的各種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡總稱，主要由外泌體、微囊泡和凋亡小體組成，EV在血漿和其他體液中含量豐富并且可以穩(wěn)定存在，攜帶來源細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸等重要生物分子，成為液體活檢的理想生物標(biāo)志物。然而EVs的尺寸只有幾十納米到幾百納米，而且異質(zhì)性強，僅僅依靠單一技術(shù)分析其濃度、尺寸、力學(xué)性質(zhì)等物理化學(xué)性質(zhì)以及蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的表達(dá)量、組成、二級結(jié)構(gòu)等信息都非常困難。近期，國家納米科學(xué)中心楊延蓮研究員、朱凌研究員和王琛研究員在期刊VIEW上發(fā)表了綜述文章“In vitro diagnostic technologies for the detection of extracellular vesicles: current status and future directions”，總結(jié)了目前從體液中分離富集EVs的方法和分析EVs生物大分子的技術(shù)，并對這些技術(shù)的難點以及臨床應(yīng)用的可行性和挑戰(zhàn)性進(jìn)行了深入的討論。本文的第一作者為國家納米科學(xué)中心中丹中心研究生宋書雅。

隨著EVs檢測技術(shù)的發(fā)展，多種EVs來源的蛋白質(zhì)和miRNA等生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等諸多疾病中顯示出良好的輔助診斷效能。目前，基于EV的臨床診斷技術(shù)的開發(fā)也大多聚焦于不同亞群特異性內(nèi)容物的檢測，主要包括核酸、蛋白質(zhì)，以及以脂質(zhì)為代表的代謝分子三大領(lǐng)域。

傳統(tǒng)的免疫分析方法，如免疫印跡法、 酶聯(lián)免疫吸附測定、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、流式細(xì)胞術(shù)等可對EVs的膜蛋白或者蛋白質(zhì)類內(nèi)容物進(jìn)行定性和/或定量檢測，質(zhì)譜技術(shù)也可以通過直接測量對特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性/定量，而且可以通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究獲得更豐富的生物信息。近年來，傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的改進(jìn)和納米級流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)，大大提高了儀器的檢測性能，使單個EVs水平的多參數(shù)分析成為可能。

另外將EVs的分離和檢測功能集成一體的微流控芯片上可改善部分傳統(tǒng)方法的缺點, 只需更少量的樣品、操作簡便、快捷省時，在臨床診斷中有巨大的應(yīng)用潛力。然而對于臨床應(yīng)用而言，EV檢測技術(shù)的先進(jìn)性以及獨一無二并不是最重要的，檢測靈敏度和特異性，工藝和分析性能的穩(wěn)定性、可靠性以及臨床價值的關(guān)聯(lián)才是最重要的。目前基于流式細(xì)胞術(shù)、磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光等的EV體外診斷技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟并走向臨床應(yīng)用。

EVs的核酸包括不同形式的RNA (mRNA、miRNA和非編碼RNA)和DNA。目前大多數(shù)研究集中在RNA上。針對RNA類內(nèi)容物，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)包括瓊脂糖凝膠電泳、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、二代測序技術(shù)（NGS）等。EVs的RNA內(nèi)容物新型檢測平臺已經(jīng)引入了實時定量PCR（RT-PCR）、數(shù)字PCR（dPCR）、數(shù)字微滴PCR（ddPCR）熒光探針、局域表面等離激元共振等技術(shù)。目前基于NGS、RT-PCT、dPCR、ddPCR等平臺的分子診斷技術(shù)比較成熟，在捕獲外泌體之后進(jìn)行核酸的突變檢測是癌癥診斷的可行方案。目前美國Exosome Diagnostics公司已經(jīng)推出了外泌體EML-4-ALK突變進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）診斷的產(chǎn)品，以及通過檢測尿液中的外泌體RNA進(jìn)行前列腺癌診斷的產(chǎn)品，并且后者已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)，這標(biāo)志著基于EV的體外診斷技術(shù)成為液體活檢領(lǐng)域的重要賽道。

除蛋白質(zhì)與核酸外，EVs中還含有以脂質(zhì)為代表的一系列代謝分子，包括膽固醇、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸等。目前，針對脂質(zhì)的檢測方法相對較少，主要為脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法，如全反射傅里葉變換紅外光譜、高效液相色譜、高通量質(zhì)譜和拉曼光譜等。不過這些方法都還停留在實驗室階段，走向臨床應(yīng)用還有一段距離。

此外，基本的機器學(xué)習(xí)算法是強大的應(yīng)用智能工具，機器學(xué)習(xí)可以實現(xiàn)EVs生物標(biāo)志物的多組分分析，結(jié)合EVs檢測技術(shù)和機器學(xué)習(xí)算法可以增加診斷準(zhǔn)確性。

盡管EV檢測和診斷方面取得了巨大的進(jìn)步，但從實驗室層面的EV生物標(biāo)志物的差異表達(dá)檢測到全面的以及EV檢測的臨床診斷仍然具有巨大的挑戰(zhàn)。首先，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化提取以及EV測試技術(shù)的；第二，EV檢測結(jié)果的重現(xiàn)性仍然值得商榷，而且很難橫向比較不同檢測平臺的測試結(jié)果，而且檢測的溯源鏈仍然缺乏；第三，距離統(tǒng)一的臨床參考區(qū)間仍然?？傮w而言，盡管仍然有很多挑戰(zhàn)性難題，EV的診斷有巨大的臨床價值，所以通過分子生物學(xué)、物理化學(xué)、工程學(xué)和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科協(xié)作，基于EV的體外診斷技術(shù)必將成為有巨大臨床價值和商業(yè)價值的液體活檢技術(shù)。