CRISPR，快速檢測(cè)HIV病毒

CRISPR技術(shù)在病毒檢測(cè)領(lǐng)域在這三年新冠疫情大放異彩。Sherlock Biosciences的Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit是首個(gè)獲得FDA EUA認(rèn)證的應(yīng)用CRISPR技術(shù)的新冠檢測(cè)產(chǎn)品，于2020年5月獲得批準(zhǔn)。除了Sherlock Biosciences，還包括Stanford University、Tunlane University、Caspr Biotech、Mammoth Bioscience等機(jī)構(gòu)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了應(yīng)用CRISPR技術(shù)的SARS-CoV-2測(cè)試。

CRISPR技術(shù)已在HIV上檢測(cè)和治療上已有巨大突破，不過(guò)近期，康涅狄格大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在ACS Nano上發(fā)表的研究《Bioinspired CRISPR-Mediated Cascade Reaction Biosensor for Molecular Detection of HIV Using a Glucose Meter》中受到CRISPR技術(shù)的啟發(fā)，開(kāi)發(fā)了一種低成本的供電的生物傳感器，用于使用類似于糖尿病家庭測(cè)試的簡(jiǎn)單個(gè)人血糖儀進(jìn)行HIV病毒的定點(diǎn)檢測(cè)。

艾滋病是世界上最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一。根據(jù)UNAIDS（聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署）最近的一份報(bào)告，強(qiáng)調(diào)了艾滋病毒項(xiàng)目進(jìn)展緩慢，2021年約有150萬(wàn)新增感染病例，超過(guò)全球目標(biāo)100萬(wàn)。

分子檢測(cè)在艾滋病毒患者的早期診斷和病毒治療中發(fā)揮著重要作用。目前艾滋病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)RT-qPCR需要昂貴的儀器和受過(guò)訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)人員來(lái)操作。因此在對(duì)快速、靈敏和低成本的艾滋病毒分子檢測(cè)方法的需求還有很大的空間。

在美國(guó)，快速便捷的HIV檢測(cè)也在最近獲得了新發(fā)展。2月18日，Chembio Diagnostics的DPP HIV-Syphilis System POCT產(chǎn)品在美國(guó)獲得FDA的CLIA豁免。屆時(shí)，美國(guó)將會(huì)有超過(guò)200,000家CLIA豁免的POC檢測(cè)點(diǎn)現(xiàn)在可以使用該系統(tǒng)檢測(cè)HIV和梅毒。

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本文主要介紹的研究中，研究團(tuán)隊(duì)表示受活細(xì)胞內(nèi)多區(qū)室結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，提出了一種膜分離、微流體、CRISPR供電的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)。通過(guò)與葡萄糖生物傳感技術(shù)相結(jié)合，它被開(kāi)發(fā)成一種便攜式、一次性診斷平臺(tái)，用于HIV病毒和其他病原體的分子檢測(cè)。

CRISPR技術(shù)是對(duì)不同病原體進(jìn)行高靈敏度和特異性核酸分子檢測(cè)的前沿技術(shù)。當(dāng)與簡(jiǎn)單的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)一起使用時(shí)，它是一種強(qiáng)大的診斷工具。然而，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)和CRISPR檢測(cè)系統(tǒng)的組合能力有限，需要單獨(dú)的反應(yīng)管和多個(gè)手動(dòng)操作，增加了污染的風(fēng)險(xiǎn)，不適合簡(jiǎn)單和有效的POC應(yīng)用。

為了提高兼容性，研究人員提出了一種納米多孔膜分離的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，并將其集成到一個(gè)簡(jiǎn)單、便攜式的CRISPR介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)（MCR）生物傳感器中，用于HIV核酸檢測(cè)，該生物傳感器使用低成本的血糖儀。該傳感器也利用了Recombinase polymerase amplification（RPA）反應(yīng)的技術(shù)，該技術(shù)是一種高靈敏度的選擇性等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

▲圖：RPA放大反應(yīng)。

重組酶蛋白與每個(gè)引物形成復(fù)合物（A），后者掃描DNA以尋找同源序列（B）。然后通過(guò)重組酶的鏈置換活性（strand-displacement activity）將引物插入同源位點(diǎn)（C），單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定置換的DNA鏈（D）。然后重組酶分解，使引物的3′端可被鏈置換DNA聚合酶（E）所接觸，從而延長(zhǎng)引物（F）。核酸片段的放大是通過(guò)循環(huán)重復(fù)這個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。

在CRISPR介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)中，多孔膜將反應(yīng)系統(tǒng)分成兩個(gè)反應(yīng)室：（i）下部RPA/RT-RPA反應(yīng)室和（ii）上部CRISPR反應(yīng)室。在HIV病毒核酸的存在下，由于DNA的指數(shù)擴(kuò)增，在Recombinase polymerase amplification（RPA）反應(yīng)室中產(chǎn)生數(shù)百萬(wàn)RPA擴(kuò)增子。由于濃度梯度（差異）和小分子尺寸，這些短擴(kuò)增子（137bp）可以容易地通過(guò)納米多孔膜擴(kuò)散到CRISPR反應(yīng)室中，這導(dǎo)致CRISPR反應(yīng)室內(nèi)CRISPR-Cas12a酶的特異性激活。

激活的CRISPR Cas12a非特異性地切割固定在磁珠上的單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合的轉(zhuǎn)化酶，導(dǎo)致釋放游離轉(zhuǎn)化酶用于下游電化學(xué)檢測(cè)。

A）在5、15和30分鐘的不同催化反應(yīng)時(shí)間后，使用葡萄糖計(jì)在生物傳感器中檢測(cè)HIV DNA。

B）在10和20分鐘的催化時(shí)間后，使用葡萄糖計(jì)在生物傳感器中檢測(cè)HIV RNARPA放大反應(yīng)。

研究人員能夠在每次測(cè)試中檢測(cè)到43份HIV DNA病毒拷貝數(shù)和200份HIV RNA病毒拷貝數(shù)的敏感性，顯示出在POCT快速檢測(cè)HIV病毒和其他傳染病的巨大潛力。