基于DNA框架結構的CRISPR三重自放大策略用于多重核酸分析

針對多個目標物的高靈敏定量檢測在臨床診斷中具有重要意義。宮頸癌是第四大常見癌癥，被世界衛(wèi)生組織認定為導致女性患病和死亡的主要原因之一，也是目前唯一病因明確且可早期預防、有望被消滅的癌癥。高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）的早期檢測和基因分型對宮頸癌的篩查、診斷和治療極為重要，WHO指南中引入HPV-DNA檢測作為宮頸癌篩查的首選方法。但是，傳統(tǒng)檢測方法依賴于核酸擴增技術，存在探針設計繁瑣、環(huán)境儀器要求高等不足。近年來，CRISPR-Cas技術賦予了核酸、蛋白質等檢測的高靈敏、高特異性以及耗時短、儀器需求低等優(yōu)勢，然而由于該技術（Cas12、Cas13等）固有的非特異性單鏈核酸切割活性，缺乏多靶標分析能力。因此，迫切需要開發(fā)基于CRISPR-Cas平臺的簡單、靈敏度高、特異性強、無需核酸擴增的多重檢測方法。

近日，四川大學吳堯研究員團隊提出了一種基于多重CRISPR-Cas12a的電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）生物檢測策略，結合DNA框架結構功能化的磁珠，憑借其三重信號自放大效應，實現(xiàn)了對HR-HPV-DNA的多重檢測和基因分型（圖1）。首先，區(qū)別于傳統(tǒng)的CRISPR生物傳感器，該策略針對HPV-16、HPV-18、HPV-52三種基因序列實施空間獨立的pre-CRISPR反應，實現(xiàn)獨立高效的多重檢測。隨后，三種分型分別與Au、Ag、Pt納米粒子的元素標記檢測對應結合，ICP-MS技術不僅可同時輸出多個信號，而且將輸出信號進一步增強放大。此外，將DNA框架結構引入磁珠界面，與單鏈DNA探針相比，DNA框架結構不但保證了探針的取向而且提高了雜交效率，探針之間足夠的空間促進了其與金屬納米粒子一對一的結合概率，提高了該方法的檢測靈敏度。

作者以HPV-16為靶標，考察該策略的可行性和檢測性能（圖2），并對DNA框架結構的檢測信號增強效應進行探究。經過一系列的參數優(yōu)化，該策略可同時對三種HR-HPV-DNA（HPV-16、HPV-18、HPV-52）相關序列進行定量分析（圖3），三種靶標在0.1~50 pM范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，建立校準曲線后，在充分考慮截距、斜率不確定度以及無需依賴核酸擴增手段的情況下，最低檢測限達200 fM。而與此對比的單鏈DNA修飾的磁珠體系靶標檢測線為2.24 pM。即DNA框架結構的引入不僅獲得更寬的檢測范圍，且信號增強10倍左右。

與熒光標記檢測方法相比，元素標記的ICP-MS技術不受光譜重疊、散射背景和生物基質物質干擾的限制，具有質量特定的單元素分辨率、多信號分析的高通量、元素之間無干擾等優(yōu)點，被認為是一種理想的多元分析工具。作者進一步考察了該策略用于多目標物檢測的選擇性和特異性（圖4），結果表明，基于ICP-MS技術的多重檢測策略具有良好的選擇性和特異性?？紤]到DNA框架結構、CRISPR Cas系統(tǒng)和ICP-MS檢測技術等的集成效果，初步探索該策略在臨床應用中的實用性。作者對15份人宮頸拭子樣本的DNA提取物進行檢測，并與DNA測序等方法進行比對。結果表明，多重檢測結果一致。綜上，本論文的設計為基于CRISPR技術的多種DNA靶標簡便、靈敏、準確檢測提供了新方法，也為ICP-MS技術的多重分析檢測實際應用提供新的思路。

相關研究結果發(fā)表在Biosensors and Bioelectronics 上，四川大學博士研究生戰(zhàn)曉輝和華西醫(yī)院實驗醫(yī)學科周娟副主任技師為文章的共同第一作者，吳堯研究員和藍芳研究員為共同通訊作者。

原文（掃描或長按二維碼，識別后直達原文頁面）：

DNA tetrahedron-based CRISPR bioassay for treble-self-amplified and multiplex HPV-DNA detection with elemental tagging

Xiaohui Zhan, Juan Zhou, Yujia Jiang, Peng An, Bin Luo, Fang Lan, Binwu Ying, Yao Wu

Biosens. Bioelectron., 2023, DOI: 10.1016/j.bios.2023.115229

通訊作者信息

吳堯：四川大學研究員，博士生導師。四川大學“生物材料表界面及體外診斷”研究團隊組長。教育部新世紀優(yōu)秀人才，四川省學術和技術帶頭人，中國生物材料學會理事兼組織委員會委員，四川省生物醫(yī)學工程學會常務理事兼秘書長，中國知識產權學會常務理事，中國科學基金第七屆編委會編委。獲教育部自然科學一等獎。圍繞磁性功能納米材料的可控構筑，致力于解決骨缺損修復以及重大疾病的臨床診治需求等挑戰(zhàn)工作。主持國家自然科學基金面上項目、973項目子課題、四川省科技廳重點研發(fā)項目等16項，橫向項目2項。累計獲批經費近3000萬元。授權中國發(fā)明專利約30項。發(fā)表SCI論文100余篇。論文總引用超過3000次，h-index=27。

https://www.x-mol.com/groups/Wu_Yao

藍芳：四川大學研究員，博士生導師。中國人體健康科技促進會臨床檢驗科學技術轉化專業(yè)委員會委員。獲唐立新優(yōu)秀學者和好未來優(yōu)秀學者獎。長期從事納米生物醫(yī)學材料和醫(yī)療器械材料表界面等研究，包括基于蛋白質、肽段、DNA和代謝物的疾病早期診斷和預后監(jiān)測，以及微環(huán)境響應的生物材料表界面改性等應用。主持包括國家自然科學基金委面上項目和青年項目、“十三五”重點研發(fā)計劃項目子課題、教育部博士點項目、四川省科技計劃項目，及四川大學優(yōu)秀青年學者研究基金（A類）等13項。以第一作者或通訊作者發(fā)表SCI源刊論文40余篇，授權中國發(fā)明專利18項，參與編寫生物材料專著1部。

文章轉載微信公眾號：X-MOL資訊