伴隨診斷的主要基因檢測(cè)方法！

伴隨診斷需要通過對(duì)樣本進(jìn)行基因測(cè)序等分析手段進(jìn)行藥物受體作用位點(diǎn)的確定，目前常用樣本類型為組織以及體液。

對(duì)組織進(jìn)行分子分析的技術(shù)稱為組織活檢，具體是指應(yīng)診斷、治療的需要，從患者體內(nèi)切取、鉗取或穿刺取出病變組織，對(duì)其進(jìn)行分子分析。

對(duì)腫瘤伴隨診斷來說，腫瘤組織活檢是獲取腫瘤 DNA 的金標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)液體進(jìn)行分析的技術(shù)稱為液體活檢，具體是指通過對(duì)患者的體液中的分析物（CTC、cfDNA、ctDNA 等）進(jìn)行分子分析，以指導(dǎo)患者的個(gè)性化治療及預(yù)后。

組織活檢與液體活檢技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

從臨床應(yīng)用上看，組織活檢與液體活檢各有優(yōu)劣。雖然目前基于液體活檢的腫瘤伴隨診斷近年來處于蓬勃發(fā)展之中，但并非意味著其已經(jīng)能取代組織活檢技術(shù)，兩者合作互補(bǔ)或許能大大提高診斷效率，減少過度治療。隨著液體活檢技術(shù)不斷發(fā)展，未來基于液體活檢的腫瘤伴隨診斷或?qū)⑦M(jìn)一步替代組織活檢技術(shù)，成為伴隨診斷檢測(cè)的主力軍。

伴隨診斷主要基因測(cè)序方法

伴隨診斷是通過基因測(cè)序等手段進(jìn)行藥物受體作用位點(diǎn)的確定，隨著靶向藥的應(yīng)用推廣，伴隨診斷逐步確立起指導(dǎo)治療的重要地位。在伴隨診斷所用檢測(cè)技術(shù)中，PCR、NGS、FISH 是目前市場(chǎng)上應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，其各有優(yōu)劣，在各大伴隨診斷企業(yè)中均有分布。

（一）PCR

PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種用于放大擴(kuò)增特定 DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，可以看作是生物體外的特殊 DNA 復(fù)制，其最大特點(diǎn)是能將微量的 DNA 大幅增加。在存在DNA模板、引物、dNTPs、適當(dāng)緩沖液 (Mg2+) 的反應(yīng)混合物中，在熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶的催化下，對(duì)一對(duì)寡核苷酸引物所界定的核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，這種擴(kuò)增是以模板 DNA與引物之間的變性、退火、延伸三步反應(yīng)為一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目標(biāo) DNA 片段得以擴(kuò)增。

最初的普通 PCR 技術(shù)只能通過對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的定性分析，這是第一代 PCR。鑒于（1）第一代 PCR 采用的核酸燃料對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境造成較大傷害，（2）PCR 完成之后開蓋檢測(cè)易污染造成假陽性結(jié)果，（3）檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且操作麻煩易出錯(cuò)及（4）只能做定性檢測(cè)，二代 PCR 得以發(fā)展并成為目前國(guó)內(nèi) PCR 技術(shù)主流。第二代 PCR 就是熒光定量 PCR 技術(shù)（Real-Time PCR），也叫做 qPCR， 是指通過應(yīng)用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針(如 Taqman Probe)，在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)基因檢測(cè)的定性和定量分析。qPCR 常用于傳染病病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究，藥物療效考核，遺傳疾病診斷。隨著反應(yīng)循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增目的基因片段呈指數(shù)增長(zhǎng)，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號(hào)強(qiáng)度，求得 Ct 值，利用已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，即可得出待測(cè)標(biāo)本目的基因數(shù)。由于 rPCR 定量過程通過 Ct 值間接反映，因此稱為第二代 PCR。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 原理圖

應(yīng)用熒光染料：SYBR green：在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量 SYBR 熒光染料，SYBR 熒光染料特異性地?fù)饺?DNA 雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。 

應(yīng)用特異標(biāo)記探針：Taqman Probe：PCR 擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR 擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的 5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步。

隨著 PCR 系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展已經(jīng)對(duì)檢測(cè)，一種具備較高靈敏度和特異性的數(shù)字PCR 技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用于腫瘤臨床檢測(cè)和科學(xué)研究中。數(shù)字PCR（Digitai PCR，dPCR）是一種新興的核酸檢測(cè)技術(shù)，通過將每個(gè)核酸分子分配到一個(gè)獨(dú)立的空間內(nèi)，避免選擇性擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的干擾，可實(shí)現(xiàn)核酸模板絕對(duì)定量、稀有突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異、DNA 甲基化、基因重排等檢測(cè)功能。由于數(shù)字 PCR 可以實(shí)現(xiàn)直接定量分析，被稱為第三代 PCR。

數(shù)字 PCR 原理圖

通過稀釋樣品 DNA 到對(duì)應(yīng)的檢測(cè)孔中，經(jīng)過 PCR 擴(kuò)增之后，向每個(gè)孔里加入特異性熒光探針與產(chǎn)物雜交，然后直接計(jì)數(shù)樣本中突變型和野生型等位子的數(shù)量。dPCR 常用于大量正常細(xì)胞群中檢測(cè)少數(shù)含突變的細(xì)胞，主要應(yīng)用于突變分析、等位基因缺失、混雜 DNA 的癌癥檢測(cè)等等。

三代 PCR 的技術(shù)優(yōu)劣

（二）NGS

NGS（高通量測(cè)序技術(shù)）是指通過模板 DNA 分子的化學(xué)修飾，將其錨定在納米孔或微載體芯片，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，在 DNA 聚合酶鏈反應(yīng)或 DNA 連接酶反應(yīng)過程中，通過采集熒光標(biāo)記信號(hào)或化學(xué)反應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)堿基序列的解讀，一次性可完成幾十萬至上百萬序列的測(cè)定。 

NGS 是基于 PCR 和基因芯片發(fā)展而來的 DNA 測(cè)序技術(shù)。一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序，而二代測(cè)序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序。二代測(cè)序在 DNA復(fù)制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記（一般為熒光分子標(biāo)記）來確定DNA 的序列。 

目前高通量測(cè)序的主要平臺(tái)代表有羅氏公司(Roche)的 454 測(cè)序儀（Roch GS FLX sequencer），Illumina 公司的 Solexa 基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和 ABI的 SOLiD 測(cè)序儀（ABI SOLiD sequencer）。

主流 NGS 測(cè)序平臺(tái)技術(shù)原理、特點(diǎn)及適用范圍

由于在二代測(cè)序中，單個(gè) DNA 分子必須擴(kuò)增成由相同 DNA 組成的基因簇，然后進(jìn)行同步復(fù)制，來增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度從而讀出 DNA 序列；而隨著讀長(zhǎng)增長(zhǎng)，基因簇復(fù)制的協(xié)同性降低，導(dǎo)致堿基測(cè)序質(zhì)量下降，目前二代最長(zhǎng)的讀長(zhǎng)是 Miseq 的 600bp。二代測(cè)序適合擴(kuò)增子測(cè)序（例如 16S、18S、ITS 的可變區(qū)），而基因組、宏基因組 DNA 則需要使用鳥槍法打斷成小片段，測(cè)序完畢后再使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行拼接。

NGS 原理圖

（三）FISH

FISH（熒光原位雜交）是一種廣泛被臨床認(rèn)可的檢測(cè)基因拷貝數(shù)變化的方法，如果被檢測(cè)的染色體或 DNA 纖維切片上的靶 DNA 與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶 DNA 與核酸探針的雜交體，將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，通過熒光顯微鏡鏡檢，對(duì)待測(cè) DNA 進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析，F(xiàn)ISH 技術(shù)可用來檢測(cè)基因擴(kuò)增、缺失及重排，如用于已知基因或序列的染色體定位、未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。

FISH 技術(shù)優(yōu)勢(shì)有：

①熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；

②探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；

③實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；

④FISH 可定位長(zhǎng)度在 1kb 的 DNA 序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；

⑤多色 FISH 通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；

⑥既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體 DNA 的結(jié)構(gòu)。

但 FISH 不能達(dá)到 100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的 cDNA 探針時(shí)效率明顯下降。 

雖然 NGS 作為新興測(cè)序技術(shù)近些年來發(fā)展勢(shì)頭迅猛，但目前市場(chǎng)上的伴隨診斷測(cè)序服務(wù)和產(chǎn)品仍以 PCR 技術(shù)為主，且與 PCR 和 NGS 相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)總體來說應(yīng)用較少。