使用Tris-EDTA處理增強從尿液中提取DNA

尿液樣本常用于通過分子檢測方法來檢測定殖在生殖道中的細菌。但是,尿液中的低濃度細菌和像尿素和結(jié)晶這樣的PCR抑制劑,會阻礙有效的DNA提取和后續(xù)的分子測試。本研究旨在開發(fā)一種優(yōu)化的尿液處理方法,以提高檢測生殖道細菌的DNA回收率。

什么原因?qū)е履蛞褐蠨NA產(chǎn)量低下?

將尿液冷藏或冷凍會導(dǎo)致結(jié)晶的形成并沉淀出溶液。這些結(jié)晶在離心過程中形成沉淀塊,會干擾DNA提取,導(dǎo)致產(chǎn)量下降。酸性的尿液pH會促進結(jié)晶的形成。加熱尿液可以溶解結(jié)晶,但有DNA降解和細菌過度生長的風(fēng)險。

如何逆轉(zhuǎn)結(jié)晶的形成?

作者在12份有明顯沉淀的尿液樣本中,測試了添加生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水(PBS)或Tris-EDTA來溶解結(jié)晶。與生理鹽水或PBS相比,Tris-EDTA所需的體積最小,可以通過提高pH和螯合鈣離子來完全溶解結(jié)晶。使用Tris-EDTA提取的細菌DNA產(chǎn)量明顯更高。

Tris-EDTA是否可以提高多種細菌的提取效率?

在尿液樣本中接種大腸桿菌和李氏乳桿菌,并比較有無加入Tris-EDTA處理的DNA回收率。兩種菌的平均產(chǎn)量在經(jīng)Tris-EDTA預(yù)處理的樣本中顯著增高。這表明了對不同細菌提取效率的改善。

這種優(yōu)化方法在臨床尿液樣本中的表現(xiàn)如何?

應(yīng)用10%體積的Tris-EDTA這一方案處理了998份男性尿液樣本,細菌濃度在101至108個16S rRNA基因拷貝/mL尿液之間。9.1%的樣本出現(xiàn)PCR抑制,但通過稀釋DNA可以解決。非淋菌尿道炎患者的尿液細菌濃度明顯更低,展示了這種提取技術(shù)的實用性。

結(jié)論

尿液冷藏過程中的結(jié)晶沉淀會降低來自生殖道細菌的DNA產(chǎn)量。在離心和提取之前使用少量Tris-EDTA預(yù)處理尿液,可以最大化細菌DNA的回收率,用于分子檢測。這種高通量、有效的方法可以生成更高質(zhì)量的尿液DNA。

參考文獻

Munch MM, Chambers LC, Manhart LE, Domogala D, Lopez A, Fredricks DN, Srinivasan S. [Optimizing bacterial DNA extraction in urine.](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6759279/) PLoS One. 2019 Sep 24;14(9):e0222962. doi: 10.1371/journal.pone.0222962. PMID: 31550285; PMCID: PMC6759279.

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