DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)全攻略

近年來(lái)涌現(xiàn)出不少DNA甲基化的檢測(cè)技術(shù)，少說(shuō)也有十幾種。大致可以分為兩類(lèi)：特異位點(diǎn)的甲基化檢測(cè)和全基因組的甲基化分析，后者也稱(chēng)為甲基化圖譜分析(methylation profiling)。下面大家介紹一些常用的方法。

1.  甲基化特異性PCR(MS-PCR)

這種方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，無(wú)需特殊儀器，因此是目前應(yīng)用最為廣泛的方法。在亞硫酸氫鹽處理后，即可開(kāi)展MS-PCR。在傳統(tǒng)的MSP方法中，通常設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，一對(duì)MSP引物擴(kuò)增經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板，而另一對(duì)擴(kuò)增未甲基化片段。若第一對(duì)引物能擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明該檢測(cè)位點(diǎn)存在甲基化，若第二對(duì)引物能擴(kuò)增出片段，則說(shuō)明該檢測(cè)位點(diǎn)不存在甲基化。

這種方法靈敏度高，可用于石蠟包埋樣本，且不受內(nèi)切酶的限制。不過(guò)也存在一定的缺陷，你要預(yù)先知道待測(cè)片段的DNA序列，并設(shè)計(jì)出好的引物，這至關(guān)重要。另外，若存在亞硫酸氫鹽處理不完全的情況，那可能導(dǎo)致假陽(yáng)性。

2.  亞硫酸氫鹽處理+測(cè)序

這種方法一度被認(rèn)為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過(guò)程如下：經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后，用PCR擴(kuò)增目的片段，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將序列與未經(jīng)處理的序列進(jìn)行比較，判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。這種方法可靠，且精確度高，能明確目的片段中每一個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，但需要大量的克隆測(cè)序，過(guò)程較為繁瑣、昂貴。

3.  聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性?xún)?nèi)切酶分析法(COBRA)

DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用限制性?xún)?nèi)切酶(BstUI)消化。若其識(shí)別序列中的C發(fā)生完全甲基化(5mCG5mCG)，則PCR擴(kuò)增后保留為CGCG，BstU I能夠識(shí)別并進(jìn)行切割;若待測(cè)序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)GTG，BstUI識(shí)別位點(diǎn)丟失，不能進(jìn)行切割。這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳分離、探針雜交、掃描定量后即可得出原樣本中甲基化的比例。

這種方法相對(duì)簡(jiǎn)單，可快速定量幾個(gè)已知CpG位點(diǎn)的甲基化，且需要的樣本量少。然而，它只能獲得特殊酶切位點(diǎn)的甲基化情況，因此檢測(cè)陰性不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能。

4.  熒光定量法(Methylight)

此種方法利用TaqMan? 探針和PCR引物來(lái)區(qū)分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亞硫酸氫鹽處理DNA片段，并設(shè)計(jì)一個(gè)能與待測(cè)位點(diǎn)互補(bǔ)的探針，隨后開(kāi)展實(shí)時(shí)定量PCR。這種方法最大的優(yōu)勢(shì)在于其高通量和高敏感性，且無(wú)需在PCR后電泳、雜交等操作，減少了污染和操作誤差。

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5.  甲基化敏感性高分辨率熔解曲線(xiàn)分析

亞硫酸氫鹽處理后，甲基化與未甲基化DNA會(huì)存在序列差異，這種差異可通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析來(lái)發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榧谆疍NA含有更多的GC，相對(duì)更難熔解。根據(jù)熔解溫度及峰型的變化，可輕易區(qū)分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技術(shù)可檢出極微小的差別。

使用這種方法進(jìn)行甲基化分析僅需一對(duì)引物，相比以往的方法更加快捷、簡(jiǎn)便和精確。不過(guò)對(duì)儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀。

6.  焦磷酸測(cè)序

焦磷酸測(cè)序技術(shù)(Pyrosequencing)作為一種新的序列分析技術(shù)，能夠快速地檢測(cè)甲基化的頻率，對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，為甲基化研究提供了新的途徑。

通過(guò)準(zhǔn)確定量單個(gè)連續(xù)的CpG 位點(diǎn)上的甲基化頻率，焦磷酸測(cè)序本身能檢測(cè)并定量甲基化水平上的細(xì)微改變。在序列延伸過(guò)程中，根據(jù)C和T的摻入量來(lái)定量確定單個(gè)位點(diǎn)的C-T 比例。因此，不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測(cè)。由于焦磷酸測(cè)序提供了真實(shí)的序列數(shù)據(jù)，甲基化狀態(tài)也就以序列形式呈現(xiàn)。

7. 基于芯片的甲基化圖譜分析

就甲基化圖譜分析而言，目前流行的分析方法是芯片。多個(gè)公司都提供了這種工具，平臺(tái)不同，過(guò)程也各異。安捷倫和NimbleGen的分析過(guò)程中，基因組DNA分成兩份，一份用來(lái)做MeDIP，另一份作為對(duì)照。兩個(gè)樣品都標(biāo)記熒光(富集的樣品用Cy5標(biāo)記，對(duì)照用Cy3標(biāo)記)，然后與芯片雜交。芯片上每個(gè)探針的Cy5/Cy3強(qiáng)度比例顯示出該區(qū)域的甲基化程度。

8.  高通量測(cè)序

新一代測(cè)序儀的飛速發(fā)展，使得測(cè)序成本大幅度下降，也使得甲基化組(methylome)的研究成為可能。近兩年，多個(gè)研究小組將傳統(tǒng)的甲基化工具(如DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化)與目標(biāo)基因組捕獲技術(shù)和高通量測(cè)序相結(jié)合，繪制出了多張甲基化圖譜。

而第三代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，更是讓甲基化的直接測(cè)定成為可能。

SMRT技術(shù)采用的是對(duì)DNA聚合酶的工作狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法。DNA聚合酶催化熒光標(biāo)記的核苷酸摻入到互補(bǔ)的核酸鏈中。核苷酸的摻入被檢測(cè)成熒光脈沖，依據(jù)其顏色鑒定出核苷酸。當(dāng)聚合酶切斷連接在核苷酸末端的熒光基團(tuán)時(shí)，脈沖終止。熒光脈沖的到達(dá)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間產(chǎn)生了關(guān)于聚合酶動(dòng)力學(xué)的信息，從而允許直接檢測(cè)DNA模板鏈中的修飾核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶。

研究人員使用這些動(dòng)力學(xué)特征，鑒定出基因組樣品中的腺嘌呤甲基化，并發(fā)現(xiàn)再結(jié)合circular consensus sequencing，他們能夠在單堿基分辨率上鑒定出表觀遺傳學(xué)修飾(mA、mC和hmC)。

9.  飛行質(zhì)譜

美國(guó)Sequenom公司的MassARRAY? 平臺(tái)也可用于DNA甲基化分析。MassARRAY? EpiTYPER? DNA 甲基化分析技術(shù)結(jié)合了堿基特異性酶切反應(yīng)和 MALDI-TOF 檢測(cè)原理，可實(shí)現(xiàn)多重CpG的分析檢測(cè)。

堿基特異性酶切(MassCLEAVE)實(shí)驗(yàn)由亞硫酸氫鹽處理待測(cè) DNA 開(kāi)始。經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理，DNA中未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，由此在DNA模板中產(chǎn)生甲基化特異的序列變化。利用 5’39; 末端帶有T7-啟動(dòng)子的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng) SAP (蝦堿性磷酸酶)處理后用于堿基特異性的酶切反應(yīng)。酶切后DNA片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化，飛行質(zhì)譜能測(cè)出每個(gè)片段的分子量，配套軟件 EpiTYPER 則能自動(dòng)報(bào)告每個(gè)相應(yīng)片段的甲基化程度。

MassARRAY甲基化檢測(cè)無(wú)需任何熒光標(biāo)記，每個(gè)反應(yīng)覆蓋長(zhǎng)達(dá)500 bp的多個(gè)CpG位點(diǎn)，且靈敏度高，可檢測(cè)低至5%的甲基化水平。