鼻咽拭子采樣診斷人呼吸道合胞病毒感染方法和原理

前期

本文件按照GB/T 1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。

本文件由中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會提出并歸口。

本文件起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、國家兒童醫(yī)學(xué)中心（北京）/首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院、首都兒科研究所、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院、國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所、長春市兒童醫(yī)院、河南省疾病預(yù)防控制中心、甘肅省疾病預(yù)防控制中心、深圳市兒童醫(yī)院、中日友好醫(yī)院。

本文件主要起草人：張燕、宋金華、謝正德、趙林清、張海鄰、劉恩梅、任麗麗、孫利偉、徐瑾、于德山、張琪、錢淵、申昆玲、許文波。

引言

人呼吸道合胞病毒是世界范圍內(nèi)引起5歲以下兒童、老年人及免疫低下人群急性下呼吸道感染最重要的病毒病原之一。人呼吸道合胞病毒感染后的臨床表現(xiàn)與其他呼吸道病毒感染引起的臨床表現(xiàn)難以區(qū)分，需要依據(jù)實驗室檢測對其進(jìn)行確切診斷。為了規(guī)范人呼吸道合胞病毒感染診斷，指導(dǎo)臨床診療和人群感染現(xiàn)狀調(diào)查，本文件遵循科學(xué)性、可行性和實用性原則，對人呼吸道合胞病毒感染診斷所需的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷進(jìn)行明確規(guī)定。

01范圍

本文件規(guī)定了人呼吸道合胞病毒感染的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷。

本文件適用于各級各類醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)。

02規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

03術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1 人呼吸道合胞病毒human respiratory syncytial virus，HRSV

人正肺病毒human orthopneumovirus

為肺炎病毒科，正肺病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組全長約15.2 kb，編碼11個蛋白質(zhì)。

04診斷依據(jù)

4.1 流行病學(xué)

當(dāng)?shù)赜蠬RSV感染發(fā)生或流行，或發(fā)病前8 d內(nèi)有HRSV感染患者接觸史。

4.2 臨床表現(xiàn)

4.2.1嬰幼兒

發(fā)病初期以鼻塞、流涕為主要表現(xiàn)，隨之出現(xiàn)咳嗽、喘息，可有低熱，體格檢查肺部聽診可聞及哮鳴音和濕啰音。嚴(yán)重者可出現(xiàn)喘憋、拒食、氣促、胸廓凹陷、發(fā)紺和鼻翼扇動。部分嬰幼兒可出現(xiàn)呼吸衰竭，并可累及呼吸系統(tǒng)以外的臟器，尤其是早產(chǎn)兒、6個月及以下的嬰兒、2歲以下患有慢性肺病或先天性心臟病等患兒。

4.2.2學(xué)齡前期兒童

以發(fā)熱、鼻塞、流涕、咳嗽為主要表現(xiàn)，體格檢查可見鼻黏膜和咽部充血、水腫。部分可進(jìn)展為肺炎，表現(xiàn)為喘息、氣促和呼吸困難，肺部聽診可聞及濕啰音及哮鳴音。

4.2.3學(xué)齡期和青春期兒童

常見癥狀有鼻塞、流涕、咳嗽、聲嘶、耳痛等，可伴發(fā)熱，體格檢查可見鼻黏膜、咽部、球結(jié)膜、鼓膜等處充血、水腫。部分可進(jìn)展為肺炎，可誘發(fā)支氣管哮喘急性發(fā)作，出現(xiàn)喘息、氣促、呼吸困難等癥狀。

4.2.4成人

以鼻塞、流涕、咽痛為主要表現(xiàn)，可伴乏力、厭食和低熱，體格檢查可見鼻黏膜、咽部等處充血、水腫。病情進(jìn)展可表現(xiàn)為急性支氣管炎、肺炎和慢性氣道疾?。ㄖ夤芟吐宰枞苑渭膊〉龋┘毙园l(fā)作，出現(xiàn)咳嗽、喘息、氣促、呼吸困難等癥狀。

4.2.5老年人及有基礎(chǔ)疾病人群

發(fā)病初期以發(fā)熱、咳嗽為主要表現(xiàn)，多數(shù)患者病情進(jìn)展快，出現(xiàn)喘息、氣促、呼吸困難等癥狀，可有發(fā)紺、胸廓凹陷，肺部聽診可聞及濕啰音及哮鳴音，嚴(yán)重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征或呼吸衰竭，部分可出現(xiàn)死亡。

4.3 實驗室檢測

4.3.1 呼吸道標(biāo)本中檢測HRSV特異性抗原陽性，詳細(xì)實驗流程按附錄A的規(guī)定執(zhí)行。

4.3.2 呼吸道標(biāo)本中檢測HRSV核酸陽性，詳細(xì)實驗流程按附錄A的規(guī)定執(zhí)行。

4.3.3 恢復(fù)期血標(biāo)本HRSV IgG抗體滴度較急性期血標(biāo)本HRSV IgG抗體滴度出現(xiàn)≥4倍升高，或急性期抗體陰性而恢復(fù)期抗體陽性，詳細(xì)實驗流程按附錄A的規(guī)定執(zhí)行。

4.3.4 呼吸道標(biāo)本中分離到HRSV，詳細(xì)實驗流程見附錄B。

05診斷原則

根據(jù)流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)和實驗室檢測結(jié)果進(jìn)行診斷。

06診斷

6.1 疑似病例

符合5.1，同時符合5.2.1、5.2.2、5.2.3、5.2.4、5.2.5中任一項。

6.2 確診病例

符合7.1，同時符合5.3.1、5.3.2、5.3.3、5.3.4中任一項。

07鑒別診斷

臨床應(yīng)注意與流感病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、人腺病毒、新型冠狀病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體等引起的呼吸系統(tǒng)感染進(jìn)行鑒別診斷，見附錄C的C.2。

附錄

A.1.1 免疫層析法檢測HRSV抗原

A.1.1.1 標(biāo)本類型與處理 

鼻咽拭子或咽拭子：將拭子放置于標(biāo)本處理液中，將拭子在管壁擠壓后取出，靜置1~3 min。

鼻咽吸取物或支氣管肺泡灌洗液：直接吸取300 μl至試管中，同時加入300 μl標(biāo)本處理液，充分混勻后，靜置1~3 min。

A.1.1.2 操作步驟 

吸取適量A.1.1.1中處理后的待檢標(biāo)本處理液加入到標(biāo)本檢測孔中，水平放置；或?qū)⒃嚰垪l浸漬區(qū)（下端）浸入A.1.1.1中處理后的待檢標(biāo)本處理液中，注意不要超出箭頭標(biāo)示的浸漬線，觀察液體浸潤至結(jié)果區(qū)后，取出試紙條，水平放置。10~15 min內(nèi)觀察結(jié)果。

A.1.1.3 結(jié)果判定 

只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條特定顏色的線，無其他線出現(xiàn)，判定為陰性；質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條特定顏色的線，同時標(biāo)本檢測位置也出現(xiàn)相同顏色的線，判定為陽性；質(zhì)控線未出，或顏色異常，則此次檢測無效，需重新檢測。

A.1.2 直接免疫熒光法（DFA）檢測HRSV

A.1.2.1 標(biāo)本類型與處理 

將含有大量脫落呼吸道上皮細(xì)胞的標(biāo)本（主要為鼻咽吸取物和支氣管肺泡灌洗液）運輸至實驗室后，450×g（2 000 r/min），離心10 min，棄上清液，加入1 ml PBS清洗2次，450×g（2 000 r/min）離心10 min，棄上清液，加入150 μl PBS吹打混勻，制備成渾濁細(xì)胞懸液。

A.1.2.2 操作步驟 

在生物安全柜內(nèi)，吸取15 μl A.1.2.1中細(xì)胞懸液滴加在潔凈玻璃片上，冷風(fēng)風(fēng)干10~15 min；浸入4 ℃ 預(yù)冷的丙酮溶液中，固定細(xì)胞10 min；固定后的玻片可置于安全柜外操作，玻片風(fēng)干后，在待檢標(biāo)本片和對照玻片的細(xì)胞點位滴加約20 μl熒光標(biāo)記的抗HRSV抗體，37 ℃，濕盒內(nèi)，孵育30 min；用PBST沖洗玻片1次，然后用PBST浸洗玻片2次（PBST不可重復(fù)使用）；除去多余液體，在細(xì)胞點位滴加約20 μl封閉液，覆上蓋玻片；將玻片置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

A.1.2.3 結(jié)果判定 

鏡下觀察細(xì)胞漿內(nèi)顯示相應(yīng)熒光標(biāo)記顏色的熒光（如FITC標(biāo)記則為綠色），說明形成了抗原抗體復(fù)合物，提示細(xì)胞內(nèi)存在HRSV抗原；如未呈現(xiàn)目的熒光不排除HRSV陽性。

A.1.3 間接免疫熒光法（IFA）檢測HRSV

A.1.3.1 標(biāo)本類型與處理 

步驟同 A.1.2.1。

A.1.3.2 操作步驟 

在待檢標(biāo)本片和對照玻片的細(xì)胞點位滴加約20 μl 1∶500倍稀釋（用含1∶40 000伊文斯藍(lán)的母液和PBS新鮮配制）的抗HRSV的抗體（第一抗體，如鼠抗HRSV），37 ℃，濕盒內(nèi)孵育30 min，先用PBST沖洗玻片1次，后用PBST浸洗玻片2次；在待檢標(biāo)本片和對照玻片的細(xì)胞點位滴加約20 μl 1∶1 000~1∶10 000倍用PBS稀釋的熒光標(biāo)記的抗第一抗體的抗體（第二抗體，如羊抗鼠IgG），37 ℃，濕盒內(nèi)孵育30 min；先用PBST沖洗掉玻片液體，后用PBST浸洗玻片2次；除去多余液體，在細(xì)胞點位滴加約20 μl封閉液，覆上蓋玻片；將玻片置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

A.1.3.3 結(jié)果判定 

鏡下觀察細(xì)胞漿內(nèi)顯示相應(yīng)熒光標(biāo)記顏色的熒光（如FITC標(biāo)記則為綠色），說明形成了抗原抗體復(fù)合物，提示細(xì)胞內(nèi)存在HRSV抗原；如未呈現(xiàn)目的熒光不排除HRSV陽性。

A.1.4 注意事項 

標(biāo)本采集后應(yīng)在4 ℃ 條件下運送至實驗室進(jìn)行檢測，4 ℃ 保存時間宜不超過48 h。

對于發(fā)病急性期采集的標(biāo)本HRSV抗原檢測陽性，說明病毒處于活躍的復(fù)制增殖狀態(tài)，可確定為現(xiàn)癥感染；HRSV抗原檢測陰性，不排除HRSV感染，臨床高度懷疑HRSV感染的，應(yīng)使用核酸檢測方法進(jìn)行驗證。

發(fā)病初期或病程較長的患者以及成人，不宜進(jìn)行HRSV抗原檢測；凍存過的標(biāo)本不宜進(jìn)行HRSV抗原檢測。

標(biāo)本細(xì)胞數(shù)不足或源自呼吸道其他部位的標(biāo)本，不適合使用免疫熒光法進(jìn)行抗原檢測。

使用免疫熒光檢測方法在抗體孵育步驟應(yīng)保持玻片濕潤，抗體需要選擇合適的稀釋度。實驗需同時設(shè)置陽性對照和陰性對照，如陽性對照和陰性對照不滿足條件，則本次實驗失敗。

標(biāo)本檢測步驟應(yīng)在遵守質(zhì)量控制和生物安全防護(hù)要求的條件下進(jìn)行操作。應(yīng)制定實驗室質(zhì)量保證計劃和實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制制度。

使用國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊批準(zhǔn)的HRSV抗原檢測商品化試劑盒，操作步驟和結(jié)果判讀及注意事項等均應(yīng)按照試劑盒說明書操作。

A.2 核酸檢測

A.2.1 標(biāo)本的類型與處理 

用于核酸檢測的標(biāo)本包括鼻咽拭子、鼻咽吸取物、咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管肺泡灌洗液、氣管內(nèi)吸取物、肺組織活檢標(biāo)本等呼吸道標(biāo)本，應(yīng)置于含有非滅活病毒保存液中。在標(biāo)本運送過程中注意低溫條件運輸，運送至實驗室后，避免反復(fù)凍融，如24 h內(nèi)無法檢測的標(biāo)本應(yīng)置于-70℃ 冰箱保存。

A.2.2 核酸提取 

使用國家藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)的試劑盒或自動核酸提取儀進(jìn)行核酸提取。嚴(yán)格按照試劑盒說明書和/或自動核酸提取儀儀器使用說明以及質(zhì)量控制和實驗室生物安全防護(hù)要求操作。

A.2.3 雙通道熒光定量RT-PCR方法檢測HRSV核酸（N基因）

A.2.3.1 引物探針序列 

參考如下引物序列，送經(jīng)評估技術(shù)成熟的生物合成公司進(jìn)行合成。

HRSVA：

上游引物：5′-AGATCAACTTCTGTCATCCAGCAA-3′

下游引物：5′-GCACATCATAATTAGGAGTATCAAT-3′

探針：5′（FAM）-CACCATCCAACGGAGCACAGGAGAT-3′（BHQ1）

HRSVB：

上游引物：5′-AAGATGCAAATCATAAATTCACAGGA-3′

下游引物：5′-TGATATCCAGCATCTTTAAGTATCTTTA TAGTG-3′

探針：

5′（CY5）-AGGTATGTTATATGCTATGTCCAGGTTAGGAAG

GGAA-3′（BHQ2）

A.2.3.2 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 

反應(yīng)體系以25 μl為例：反應(yīng)緩沖液12.5 μl，20 μmol/L的A亞型上下游引物各0.5 μl，5 μmol/L的探針0.5 μl，B亞型上下游引物各0.5 μl，5 μmol/L的探針0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄/DNA聚合酶1 μl，核酸模板5 μl，加DEPC水3.5 μl補齊25 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性10 s，55 ℃ 退火30 s，收集熒光信號，40個循環(huán)。

A.2.3.3 結(jié)果判定 

在儀器正常，同一實驗中陰性對照、陽性對照均正常的情況下進(jìn)行結(jié)果分析：

——待測標(biāo)本檢測結(jié)果CT≤35，曲線呈S型且有明顯指數(shù)增長期，判斷為陽性。

——待測標(biāo)本檢測結(jié)果35<CT≤38，此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重讀結(jié)果CT值仍然在35~38范圍，曲線呈S型且有明顯指數(shù)增長期，則判斷為陽性，否則判斷為陰性。

——待測標(biāo)本檢測結(jié)果CT>38或未檢出，此次結(jié)果判斷為陰性。

A.2.4 注意事項 

標(biāo)本采集后應(yīng)在4 ℃ 條件下運送至實驗室進(jìn)行檢測，4 ℃ 保存時間宜不超過24 h。如24 h內(nèi)無法檢測的標(biāo)本應(yīng)置于-70 ℃ 冰箱保存，標(biāo)本不宜反復(fù)凍融。

閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照的熒光信號的最高點，結(jié)果顯示陰性為準(zhǔn)，或可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。陰性對照為無典型S型擴增曲線顯示；陽性對照呈典型S型擴增曲線且CT值≤30；閾值、陰性對照和陽性對照的要求需在同一實驗中同時滿足，否則本次實驗無效。

應(yīng)定期評估引物、探針序列，防止單核苷酸多態(tài)性和其他突變導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

檢測步驟應(yīng)在同時遵循質(zhì)量控制和生物安全防護(hù)要求的條件下進(jìn)行操作。

使用國家藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)的HRSV核酸檢測商品化試劑盒，操作步驟和結(jié)果分析以及結(jié)果判讀等均應(yīng)按照試劑盒說明書操作。

A.3 血清學(xué)檢測

A.3.1 血清標(biāo)本的采集與處理 

用真空負(fù)壓無抗凝劑的采血管采集血液標(biāo)本3~5 ml，室溫靜置30 min，250×g（1 500 r/min）~450×g（2 000 r/min）離心10 min，小心吸取血清，避免吸到紅血球，在無菌條件下，移至帶外螺旋蓋的血清管中，在管壁上做好標(biāo)記。

A.3.2 定量ELISA法檢測HRSV IgG抗體

A.3.2.1 應(yīng)使用1 000 μl稀釋緩沖液對10 μl患者待測樣品進(jìn)行稀釋，制成患者標(biāo)本稀釋液，最終標(biāo)本稀釋比例為1∶100。

A.3.2.2 將檢測所需數(shù)目的微孔條放到微孔板框上并準(zhǔn)備好一張標(biāo)簽。在微量孔內(nèi)分別加入100 μl的己稀釋標(biāo)本或立即可用的對照血清。留一個孔作為底物空白，示例見 表1 。將樣品于濕盒內(nèi)（37±1）℃ 孵育（60±5）min。

圖片

表1ELISA法檢測 HRSV IgG抗體微量孔加樣示例

A.3.2.3 孵育后以洗液緩沖液洗滌板孔（使用自動洗板機或手工洗板）。先吸去或甩去洗液，然后每孔內(nèi)加入300 μl洗液，再吸去或甩去洗液，重復(fù)洗滌過程共4次。最后將微孔板翻轉(zhuǎn)過來在紙巾上拍干，使微孔中不再含有液體。

A.3.2.4 加入酶標(biāo)記抗體：于相應(yīng)孔內(nèi)（底物空白孔除外）加入100 μl IgG酶標(biāo)記抗體，濕盒內(nèi)（37±1）℃ 孵育（30±1）min。

A.3.2.5 以洗液緩沖液洗滌板孔，操作步驟同A.3.2.3。

A.3.2.6 于每孔內(nèi)加入100 μl底物溶液（包括底物空白孔），濕盒內(nèi)（37±1）℃ 孵育（30±1）min。

A.3.2.7 每孔內(nèi)加入100 μl終止液，輕微振蕩微孔板以混合溶液。

A.3.2.8 讀取OD值：以底物空白孔為空白對照，60 min內(nèi)讀取OD值。

A.3.3 結(jié)果判定 

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清OD值計算CUT-OFF值上限和下限，根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)本中抗體活性值：

標(biāo)本OD值≥CUT-OFF值上限，結(jié)果判定為陽性。

標(biāo)本OD值<CUT-OFF值下限，結(jié)果判定為陰性。

在標(biāo)本OD值在CUT-OFF值上限和下限之間，結(jié)果判定為可疑。

A.3.4 注意事項 

血清標(biāo)本在4 ℃ 條件下，存放時間宜不超過3 d，-20 ℃ 以下可長期保存，標(biāo)本不宜反復(fù)凍融。

底物空白孔的OD值必須<0.25；陰性對照必須為陰性；標(biāo)準(zhǔn)血清的平均OD值必須在有效范圍內(nèi)，此范圍已在試劑盒專用的質(zhì)量控制證書中給定（減去底物空白之后）；如果未達(dá)到以上標(biāo)準(zhǔn)，則此次實驗無效且必須重做。

ELISA法檢測HRSV IgG抗體主要用于定性和/或定量檢測人血清或血漿中抗HRSV的IgG抗體，用于HRSV感染診斷或人群抗體水平調(diào)查。

特異性IgG抗體在急性期陰性而恢復(fù)期轉(zhuǎn)為陽性，或恢復(fù)期特異性IgG抗體滴度較急性期IgG抗體滴度升高4倍及以上，提示疾病過程有HRSV感染。

應(yīng)制定實驗室質(zhì)量保證計劃和實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制制度。使用國家食品藥品監(jiān)督管理總局注冊批準(zhǔn)的HRSV血清學(xué)檢測商品化試劑盒，操作步驟和結(jié)果分析以及結(jié)果判讀等均應(yīng)按照試劑盒說明書操作。

B.1 病毒分離

B.1.1 細(xì)胞系 

敏感細(xì)胞系為異倍體細(xì)胞或二倍體細(xì)胞，如人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、恒河猴腎細(xì)胞RMK和非洲綠猴腎細(xì)胞Vero等，其中人喉癌上皮細(xì)胞Hep-2敏感性好，較為常用。

B.1.2 接種 

HRSV病毒分離需使用新鮮標(biāo)本，床旁接種。取傳代后24~48 h內(nèi)、細(xì)胞生長狀態(tài)良好、50%貼壁細(xì)胞的斜面管，棄生長液，加入0.2 ml處理后的新鮮標(biāo)本液，室溫吸附1~2 h后棄液，加入1 ml維持液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日觀察有無細(xì)胞毒性，必要時換液；或取細(xì)胞傳代后24~48 h內(nèi)、細(xì)胞生長狀態(tài)良好、約50%貼壁細(xì)胞的斜面管，棄生長液，加0.8 ml維持液，接種0.2 ml標(biāo)本液后直接置于33 ℃ 培養(yǎng)箱，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，次日換新鮮維持液。

B.1.3 觀察 

CPE HRSV的CPE表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓變大發(fā)亮，細(xì)胞內(nèi)顆粒性物質(zhì)增多，細(xì)胞邊界消失，細(xì)胞融合為多核巨細(xì)胞。

在光學(xué)顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞生長和病變情況。25%細(xì)胞出現(xiàn)融合標(biāo)記為+，50%細(xì)胞出現(xiàn)融合記為++，75%細(xì)胞出現(xiàn)融合記為+++，100%細(xì)胞出現(xiàn)融合記為++++。

B.1.4 傳代 

顯微鏡下觀察至第5~7天，如無CPE出現(xiàn)，直接吸取上清（不應(yīng)凍化）進(jìn)行盲傳，盲傳步驟同B.1.2。盲傳2代后無CPE出現(xiàn)，確定病毒分離結(jié)果為陰性。

B.1.5 毒株鑒定 

在CPE達(dá)到++~+++時，吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞從管壁脫落，450×g（2 000 r/min），離心10 min，上清吸至無菌凍存管，使用核酸檢測方法進(jìn)行鑒定；細(xì)胞沉淀使用抗原檢測方法進(jìn)行鑒定。具體操作步驟按照附錄A執(zhí)行。

B.1.6 毒株保存 

陽性毒株加入等體積50%的FBS或者50%的蔗糖凍存于-70 ℃ 冰箱中。

B.1.7 注意事項 

HRSV分離，需采集標(biāo)本后床旁接種，凍存后的標(biāo)本不宜進(jìn)行病毒分離。

HRSV連續(xù)傳代，中間不應(yīng)凍化。復(fù)蘇時，將加入保護(hù)劑即FBS或蔗糖的毒株，經(jīng)20倍稀釋后接種到新的24孔板或斜面管中，逐天觀察病變。

HRSV陽性或觀察到第5天，需傳下一代時，直接將細(xì)胞刮下，不經(jīng)凍化，450×g（2 000 r/min），離心10 min，吸取上清接種下一代。

HRSV毒株或標(biāo)本需要放置于-70 ℃ 冰箱保存。

B.2 中和試驗（微量中和法）

B.2.1 準(zhǔn)備單層細(xì)胞 

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入0.1 ml Hep-2細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為2×105個/ml，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到90%，整個過程應(yīng)無菌操作。

B.2.2 病毒液準(zhǔn)備 

采用含2%FBS的新鮮維持液將原病毒液稀釋成200 CCID50/0.1 ml的標(biāo)準(zhǔn)病毒液，置于4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

B.2.3 血清滅活 

待檢血清56 ℃ 水浴30 min。

B.2.4 血清稀釋 

基于倍比稀釋的原則，以1份待檢血清為例，吸取100 μl待檢血清加入到含有900 μl新鮮維持液的無菌離心管中，渦旋震蕩混勻，制備成第1管（稀釋梯度為1∶10）；吸取500 μl第1管中稀釋后的血清加入到含有500 μl新鮮維持液的無菌離心管中，渦旋震蕩混勻，制備成第2管（稀釋梯度為1∶20）；吸取500 μl第2管中稀釋后的血清加入到含有500 μl新鮮維持液的無菌離心管中，制備成第3管（稀釋梯度為1∶40），此后均按照倍比進(jìn)行稀釋，直至吸取500 μl第7管中稀釋后的血清加入到含有500 μl新鮮維持液的無菌離心管中，渦旋震蕩混勻，棄掉500 μl，制備成第8管（稀釋梯度為1∶1 280）。

B.2.5 接種病毒 

棄96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，陰性對照每孔加入200 μl維持液，平行做4個副孔；病毒陽性對照每孔加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)病毒液（200 CCID50/0.1 ml）和100 μl維持液，平行做4個副孔；B.2.4中稀釋后的每管待檢血清平行做4個副孔，每孔加入100 μl相應(yīng)稀釋梯度的待檢血清和100 μl標(biāo)準(zhǔn)病毒液。

置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，逐天觀察并記錄CPE至第7天。

B.2.6 結(jié)果判定 

用Karber法或Reed-Muench法計算待檢血清的中和終點（即能夠保護(hù)50%細(xì)胞不受100 CCID50病毒感染的血清樣品最高稀釋度），為該血清樣品的中和抗體滴度。中和試驗陽性提示機體對HRSV具有一定的保護(hù)性，抗體滴度越高說明抗HRSV的能力越強。

B.2.7 注意事項 

中和試驗應(yīng)使用新鮮病毒液，不宜使用凍存后稀釋的病毒液。

該方法僅用于HRSV相關(guān)科學(xué)研究工作。

B.3 靶基因擴增及測序

B.3.1 引物序列 

參考如下引物序列，送經(jīng)評估技術(shù)成熟的生物合成公司進(jìn)行合成。

HRSVA（擴增片段長度為540 bp）：

上游引物5′-GAAGTGTTCAACTTTGTACC-3′

下游引物5′-CAACTCCATTGTTATTTGCC-3′

HRSVB（擴增片段長度為550 bp）：

上游引物5′-AAGATGATTACCATTTTGAAGT-3′

下游引物5′-CAACTCCATTGTTATTTGCC-3′

B.3.2 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 

反應(yīng)體系以25 μl為例：反應(yīng)緩沖液12.5 μl，20 μmol/L的上下游引物各0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄/DNA聚合酶1 μl，核酸模板5 μl，加DEPC水5.5 μl補齊25 μl。反應(yīng)條件：50 ℃ 逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 終末延伸10 min。

B.3.3 測序 

PCR產(chǎn)物可送經(jīng)評估技術(shù)成熟的生物測序公司進(jìn)行序列測定。

B.3.4 序列整理和分析 

從生物公司返回的序列資料，以標(biāo)準(zhǔn)的圖形文件（.ab1）保存。序列整理使用相關(guān)序列分析軟件分別對序列進(jìn)行編輯和分析。

B.3.5 注意事項 

制定實驗室質(zhì)量保證計劃和實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制制度；注意定期評估引物序列，防止單核苷酸多態(tài)性和其他突變導(dǎo)致的假陰性結(jié)果；注意觀察測序結(jié)果峰圖的質(zhì)量，保證每個堿基位點測序準(zhǔn)確性。

該方法僅用于HRSV相關(guān)科學(xué)研究工作。

B.4 宏基因組測序

B.4.1 試劑與操作 

使用商品化試劑盒嚴(yán)格按照操作說明書以及生物安全防護(hù)進(jìn)行核酸提取、標(biāo)本前處理、文庫構(gòu)建等。

B.4.2 文庫質(zhì)檢 

文庫完成后采用熒光染料法檢測濃度，同時通過熒光PCR法檢測文庫中有效連接接頭的片段濃度。建庫后文庫的濃度應(yīng)不低于測序平臺上機要求的最低濃度。

B.4.3 文庫測序 

上機前根據(jù)不同測序平臺的要求對文庫進(jìn)行稀釋。用高通量測序儀對構(gòu)建的文庫進(jìn)行測序，操作符合測序儀生產(chǎn)企業(yè)的要求。建議單個標(biāo)本測序數(shù)據(jù)量不低于20兆讀序數(shù)。序列的單端讀長不少于50 bp。

B.4.4 數(shù)據(jù)處理 

將下機數(shù)據(jù)進(jìn)行無效序列和重復(fù)序列的過濾，單個標(biāo)本的數(shù)據(jù)拆分后，基于參比數(shù)據(jù)庫開展病原分析，形成報告。

B.4.5 結(jié)果判定 

應(yīng)確認(rèn)內(nèi)部質(zhì)控正常，宏基因組測序HRSV陽性結(jié)果可開展病毒基因組序列分析。陰性檢測結(jié)果不能排除HRSV的感染。

B.4.6 注意事項 

宏基因組實驗的功能分區(qū)參照《基于高通量測序的病原體篩查通用準(zhǔn)則》（T/CPMA 010/2020）進(jìn)行。該方法僅用于HRSV相關(guān)科學(xué)研究工作。

C.1 流行特征

HRSV呈全球廣泛流行。寒/溫帶地區(qū)主要在冬春季流行；在熱帶和亞熱帶地區(qū)，雨季感染率出現(xiàn)明顯增高。我國北方地區(qū)，流行高峰通常在10月中旬至次年5月中旬；我國南方地區(qū)，流行高峰常為冬季和潮濕雨季，其他時間也偶有檢出。

可通過接觸和呼吸道傳播。主要通過接觸含病毒的分泌物或污染物傳播，飛沫和氣溶膠也可引起傳播。

高危人群主要集中在嬰幼兒、老年人及有基礎(chǔ)疾病人群，也可以引起其他年齡段人群急性呼吸道感染。

C.2 鑒別診斷

C.2.1 流感病毒感染 

流感病毒按其核心蛋白可分為甲、乙、丙、丁四種類型，在人群中呈季節(jié)性流行的是甲型和乙型流感病毒。好發(fā)于冬春季節(jié)，臨床表現(xiàn)以高熱、乏力、頭痛、全身肌肉酸痛等全身癥狀為主，而呼吸道癥狀較輕，抗菌藥物治療無效，早期應(yīng)用抗流感病毒藥物治療有效。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.2 鼻病毒感染 

好發(fā)于夏秋季，相較于HRSV感染，鼻病毒感染患兒年齡偏大，多有喘息史和濕疹史，發(fā)熱峰值高。不同種鼻病毒引起的毛細(xì)支氣管炎臨床表現(xiàn)略不同，A種和C種鼻病毒引起的毛細(xì)支氣管炎病情較重，C種鼻病毒單一感染引起的毛細(xì)支氣管炎可出現(xiàn)外周血嗜酸性粒細(xì)胞、血清IgE水平增高。過敏體質(zhì)患兒感染鼻病毒可引起反復(fù)喘息甚至哮喘發(fā)生。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.3 人偏肺病毒感染 

好發(fā)于晚冬和春季，流行高峰與HRSV同步或稍后。相較于HRSV感染，人偏肺病毒感染患兒年齡偏大。男性多于女性，潛伏期3~5 d。人偏肺病毒肺炎臨床表現(xiàn)差異較大，發(fā)病初期表現(xiàn)為上呼吸道感染癥狀，發(fā)熱多在38 ℃ 以下。嚴(yán)重病例可以出現(xiàn)呼吸增快、喘息、三凹征和發(fā)紺等，肺部聽診可聞及細(xì)小或粗中濕啰音。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.4 副流感病毒感染 

全年均可發(fā)病，副流感病毒3型是引起嬰幼兒下呼吸道感染常見病毒病原，多見于1歲內(nèi)的嬰兒，臨床表現(xiàn)與HRSV感染類似，可出現(xiàn)肺炎或毛細(xì)支氣管炎表現(xiàn)。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.5 人腺病毒感染 

好發(fā)于我國北方地區(qū)的冬春季，南方地區(qū)多見于夏秋季，常見于6個月至2歲的嬰幼兒，可引起咽結(jié)合膜炎和肺炎。其中7型人腺病毒是引起嬰幼兒重癥肺炎的常見型別，臨床表現(xiàn)為持續(xù)稽留熱、全身感染中毒癥狀重、呼吸衰竭等，早期咽部可出現(xiàn)石灰點樣分泌物。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.6 新型冠狀病毒感染 

全年均可發(fā)病，傳染性強，奧密克戎系列變異株潛伏期多為2~4 d。主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咽干、咽痛、咳嗽、乏力等，發(fā)熱多為中低熱，部分病例亦可表現(xiàn)為高熱，熱程多不超過5 d；部分患者可伴有肌肉酸痛、嗅覺味覺減退或喪失、鼻塞、流涕、結(jié)膜充血等；部分患者表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉等消化道癥狀或僅表現(xiàn)為反應(yīng)差、呼吸急促；少數(shù)可出現(xiàn)聲音嘶啞、呼吸困難、喘息等，極少數(shù)患者出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸窘迫、肺外器官受損甚至死亡。兒童感染后臨床表現(xiàn)與成人相似，高熱相對多見。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.7 肺炎衣原體感染 

常引起急性呼吸道感染，最常表現(xiàn)為肺炎，亦可引起支氣管炎、咽炎及扁桃體炎等，可有發(fā)熱、持續(xù)咳嗽、全身不適、咽痛及聲音嘶啞等，病程可持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月。原有支氣管哮喘的患者感染肺炎衣原體后，可加重病情。病情嚴(yán)重者可因原基礎(chǔ)疾病加重或發(fā)生并發(fā)癥如細(xì)菌感染而死亡。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

C.2.8 肺炎支原體感染 

容易在幼兒園、學(xué)校等人員密集的環(huán)境中發(fā)生，經(jīng)飛沫和直接接觸傳播，潛伏期1~3周，潛伏期內(nèi)至癥狀緩解數(shù)周均有傳染性。起病可急可緩，以發(fā)熱和咳嗽為主要表現(xiàn)。中、高度發(fā)熱多見，也可低熱或無熱。病初大多呈陣發(fā)性干咳，少數(shù)有黏痰，偶有痰中帶血絲，咳嗽會逐漸加劇，可出現(xiàn)百日咳樣痙攣性咳嗽。病程可持續(xù)2周甚至更長。多數(shù)患兒精神狀況良好，多無氣促和呼吸困難。年長兒肺部體征出現(xiàn)較晚，可出現(xiàn)肺部實變體征。依據(jù)病原學(xué)檢查可確診。

參考文獻(xiàn)

[1]中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會. 基于高通量測序的病原體篩查通用準(zhǔn)則:T/CPMA 010—2020[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2022:141-150.

[2]中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會. 老年健康與老年服務(wù)名詞術(shù)語:T/CPMA 018—2020[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2022:269-288.

[3]J Yu , C Liu , Y Xiao ,et al. Respiratory Syncytial Virus Seasonality, Beijing, China, 2007-2015[J]. Emerg Infect Dis, 2019,25(6):1127-1135.

[4]Z Xie , Q Qin , K Shen ,et al. The burden of respiratory syncytial virus associated with acute lower respiratory tract infections in Chinese children:a meta-analysis[J]. Transl Pediatr, 2020,9(4):496-506.

[5]崔愛利,朱貞,毛乃穎,等. 2009—2021年中國九省份發(fā)熱呼吸道癥候群監(jiān)測病例中常見病毒感染情況分析[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2022,56(7):912-918.

[6]J Song , Z Zhu , J Song ,et al. Circulation pattern and genetic variation of human respiratory syncytial virus in China during 2008-2021[J]. J Med Virol, 2023,95(3):e28611.

[7]Q Luo , M Li , A Li ,et al. Genetic diversity and epidemiological features of respiratory syncytial virus, Beijing, 2015-2019:a multicenter and all-age groups study[J]. J Infect, 2022,85(1):75-85.

[8]謝正德,徐保平,陳祥鵬,等. 兒童呼吸道合胞病毒感染診斷、治療和預(yù)防專家共識[J]. 中華實用兒科臨床雜志, 2020,35(4):241-250.

[9]C Chartrand , N Tremblay , C Renaud ,et al. Diagnostic accuracy of rapid antigen detection tests for respiratory syncytial virus infection:systematic review and meta-analysis[J]. J Clin Microbiol, 2015,53(12):3738-4379.

[10]C Griffiths , S J Drews , D J Marchant . Respiratory syncytial virus:infection, detection, and new options for prevention and treatment[J]. Clin Microbiol Rev, 2017,30:277-319.

[11]L J Van-elden , A M Van-loon , B A Van-der ,et al. Applicability of a real-time quantitative PCR assay for diagnosis of respiratory syncytial virus infection in immunocompromised adults[J]. J Clin Microbiol, 2003,41(9):4378-4381.

[12]T C Peret , C B Hall , K C Schnabel ,et al. Circulation patterns of genetically distinct group A and B strains of human respiratory syncytial virus in a community[J]. J Gen Virol, 1998,79(Pt 9):2221-2229.

[13]《中華兒科雜志》編輯委員會,中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會呼吸學(xué)組. 毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識(2014年版)[J]. 中華兒科雜志, 2015,53(3):168-171.

[14]中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會,國家中醫(yī)藥局. 兒童社區(qū)獲得性肺炎診療規(guī)范(2019年版)[J]. 中華臨床感染病雜志, 2019,12(1):6-13.