倪曉平丨醫(yī)院環(huán)境微生物標(biāo)本采集與檢驗(yàn)方法

講者丨倪曉平（杭州市疾病預(yù)防控制中心）

整理丨雷曉婷（江蘇省中醫(yī)院)

審稿丨王玉蘭(佛山復(fù)星禪誠醫(yī)院)

來源丨2021年SIFIC全國(guó)感控與耐藥感染大會(huì)

醫(yī)院環(huán)境微生物采樣監(jiān)測(cè)是醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)重要工作之一。通過環(huán)境微生物監(jiān)測(cè)考核評(píng)價(jià)環(huán)境清潔與消毒質(zhì)量；評(píng)價(jià)空氣凈化質(zhì)量、環(huán)境物表的消毒效果等等；當(dāng)懷疑醫(yī)院感染暴發(fā)或疑似院感暴發(fā)與環(huán)境有關(guān)時(shí)，對(duì)環(huán)境衛(wèi)生學(xué)的調(diào)查是不可或缺的，因此掌握正確的環(huán)境衛(wèi)生學(xué)采集及檢驗(yàn)方法非常必要，也是感控人的必修課。在2021年SIFIC全國(guó)感控與耐藥感染大會(huì)上，來自杭州市疾病預(yù)防控制中心倪曉平教授的《醫(yī)院環(huán)境微生物標(biāo)本采集與檢驗(yàn)方法》精彩講座，相信大家學(xué)習(xí)后對(duì)不同標(biāo)本采集與檢驗(yàn)方法會(huì)有更清晰的認(rèn)識(shí)。

一、環(huán)境微生物采集的目的

考核環(huán)境清潔與消毒質(zhì)量；

評(píng)價(jià)空氣凈化消毒效果；

評(píng)價(jià)環(huán)境表面消毒劑消毒效果；

調(diào)查與感染暴發(fā)的關(guān)系；

環(huán)境表面在傳播病原菌作用的研究；

工程控制--表面材料的抗菌作用的研究。

環(huán)境微生物采集的目的不同，醫(yī)院感染環(huán)境微生物檢測(cè)的策略也不同。

二、環(huán)境微生物采集方法

（一）不同采樣目的所遵循的規(guī)范要求不同

以考核清潔消毒質(zhì)量為目的時(shí)，應(yīng)按照既有規(guī)范的要求采樣，如采樣面積、采樣工具（使用棉簽涂抹法）等應(yīng)符合規(guī)范要求。培養(yǎng)介質(zhì)、實(shí)驗(yàn)條件、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)嚴(yán)格遵守規(guī)范，并做好陰性、陽性對(duì)照，進(jìn)行微生物檢測(cè)質(zhì)量控制。

水標(biāo)本盡量用藍(lán)口瓶采集。如使用帶軟塞的試管，應(yīng)配合酒精燈。采樣器具放置在采樣箱內(nèi)攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)，有條件的，試管架和其它采樣器具分別放置。

必要時(shí)采樣后的試管置于冰包內(nèi)，以免檢驗(yàn)前增菌。采樣時(shí)采取必要的個(gè)人防護(hù)、做手衛(wèi)生。

根據(jù)GB-15982《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，懷疑醫(yī)院感染暴發(fā)或疑似暴發(fā)與醫(yī)院環(huán)境有關(guān)時(shí)，應(yīng)對(duì)各類環(huán)境空氣、物體表面、工作人員手等進(jìn)行目標(biāo)微生物檢測(cè)。如醫(yī)務(wù)人員手、醫(yī)療器械、治療用水、防護(hù)用品、消毒劑、消毒器械、污水的采樣。

以調(diào)查環(huán)境與感染暴發(fā)的關(guān)系為目的采樣時(shí)，可有多種方法：如海綿棒涂抹法（可以做大面積1m2采樣）、平皿接觸法（RODAC平皿）、載玻片接觸法、薄膜粘貼法（用于可吸水的軟質(zhì)表面，如棉被、枕頭、工作服等）。選用不同的采樣工具，不限制采樣面積，以盡可能捕捉到病原體。培養(yǎng)介質(zhì)可以用選擇性培養(yǎng)基，也可以增菌。

（二）目標(biāo)細(xì)菌監(jiān)測(cè)

杭州疾控中心曾對(duì)醫(yī)院自測(cè)陰性的環(huán)境采樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：某市級(jí)醫(yī)院ICU 環(huán)境表面MRSA陽性率100%，某省級(jí)醫(yī)院NICU的環(huán)境MRSA陽性率50%。陽性率高的原因是，CDC使用了高分子材料采樣拭子和MRSA選擇性培養(yǎng)基。

高分子纖維拭子對(duì)環(huán)境表面細(xì)菌的吸附能力優(yōu)于普通棉簽，而針對(duì)特定病原菌的選擇性培養(yǎng)基，較普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，更容易篩選出環(huán)境中一些非優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)的致病菌。選擇性培養(yǎng)基可選國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口產(chǎn)品，或自行配置。實(shí)驗(yàn)室要注意實(shí)驗(yàn)室生物安全。

疑似院感暴發(fā)調(diào)查：杭州CDC曾參與某醫(yī)院ICU病房疑似醫(yī)院感染暴發(fā)調(diào)查，采集環(huán)境標(biāo)本121份，有菌落生長(zhǎng)的環(huán)境表面有113份（93.4%），挑取750個(gè)菌落進(jìn)行鑒定，鑒定出1種細(xì)菌的表面有30處（24.8%），最多的一處表面鑒定出8種細(xì)菌。而醫(yī)院采樣未見明顯結(jié)果。時(shí)間成本上看，普通PCR培養(yǎng)需要7天以上，耗材3.5萬元，高于MS。

（三）采樣時(shí)機(jī)的選擇

采樣時(shí)機(jī)也很重要。采樣時(shí)應(yīng)了解，環(huán)境表面最后一次清潔消毒是什么時(shí)候？是清潔前還是清潔后？清潔后多長(zhǎng)時(shí)間？

日常監(jiān)測(cè)，采樣時(shí)機(jī)選擇清潔后；如果做流行病學(xué)調(diào)查，應(yīng)選擇清潔前，還可以現(xiàn)場(chǎng)接種或進(jìn)行增菌。

（四）日常監(jiān)測(cè)注意事項(xiàng)

規(guī)范采樣與實(shí)驗(yàn)；

針對(duì)性配制中和劑；

不得增菌、富集手段；

傾注培養(yǎng)、采樣液劑量；

培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度與時(shí)間；

微生物檢測(cè)質(zhì)量控制：

（1）培養(yǎng)基考核；

（2）陰、陽性對(duì)照；

（3）采樣液富集（離心、膜濾、增菌等）。

（五）空氣采樣方法

空氣采樣方法有兩種：被動(dòng)采樣和主動(dòng)采樣。

被動(dòng)采樣：自然沉降。基于采樣區(qū)域空氣中的顆粒物（細(xì)菌、真菌孢子）在重力作用下的自然沉降而將其捕獲。對(duì)于粒徑小、長(zhǎng)時(shí)間懸浮空氣中的病原體，可能無法獲取。如，真菌孢子直徑1~2微米，每小時(shí)沉降僅0.1~0.4米，被動(dòng)采樣捕捉到的概率就很小。

主動(dòng)采樣：動(dòng)力抽氣?；趧?dòng)力風(fēng)機(jī)抽氣收集采樣區(qū)域空氣中顆粒物（細(xì)菌、真菌孢子）的采樣方法?？蓻Q定采多大體積的空氣。如單極空氣采樣器，儀器抽吸空氣通過培養(yǎng)介質(zhì)表面，通過控制采樣時(shí)間調(diào)整采集樣本的體積，可以在疑似污染源周圍使用。

兩級(jí)氣溶膠采樣器能將不同粒徑顆粒物分層捕捉，獲得不同大小顆粒物的陽性率。六級(jí)Andersen采樣器，可對(duì)不同粒徑的顆粒物進(jìn)行捕獲。

口罩采樣：有人對(duì)口罩采樣進(jìn)行研究，感染患者佩戴含有濾膜的口罩，通過口罩濾過面來收集空氣中的病原體。這種方法能連續(xù)收集標(biāo)本，據(jù)報(bào)道，口罩標(biāo)本中結(jié)核桿菌檢出率（86%）明顯高于普通痰標(biāo)本（21%），作者認(rèn)為口罩采樣是連續(xù)收集標(biāo)本，而痰標(biāo)本除標(biāo)本質(zhì)量外，更關(guān)鍵的是某個(gè)“點(diǎn)”時(shí)間的采樣。

（六）水源性微生物檢測(cè)方法

檢測(cè)目的：醫(yī)療機(jī)構(gòu)用水主要是以城市自來水為基礎(chǔ)，因水源污染造成的醫(yī)院感染暴發(fā)已不鮮見，使用污染的水沖洗醫(yī)療器械，或用其洗手后進(jìn)行侵入性操作，都可能增加感染風(fēng)險(xiǎn)。1990年至2012年文獻(xiàn)報(bào)道醫(yī)療機(jī)構(gòu)水源性醫(yī)院感染暴發(fā)事件多達(dá)125起，因此，對(duì)水源性微生物檢測(cè)非常重要。

微生物特點(diǎn)：

（1）微生物主要由碳元素構(gòu)成，含量占菌體干物質(zhì)質(zhì)量的一半，其生長(zhǎng)主要需要C、N、S等物質(zhì)。微生物生長(zhǎng)與繁殖所需要的環(huán)境溫度有很大區(qū)別，如可以分為低溫（22℃）、中溫（36℃）、耐熱（44℃）生長(zhǎng)。

（2）按照細(xì)菌生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)獲取的方式，分為自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌。通常我們使用的培養(yǎng)溫度在36℃左右（溫度接近人體溫度），如有菌生長(zhǎng)，更多考慮病原菌來自人體。如果44℃條件培養(yǎng)陽性，應(yīng)考慮為土壤環(huán)境細(xì)菌。如果22℃條件培養(yǎng)陽性，應(yīng)考慮為水源環(huán)境細(xì)菌。

監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)：

（1）目前，國(guó)際上對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)用水的微生物監(jiān)測(cè)方法缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。醫(yī)療機(jī)構(gòu)用水微生物檢測(cè)，執(zhí)行GB/T 5750.12-2006《生活飲用水檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》規(guī)定的菌落數(shù)檢測(cè)方法，即水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，有氧條件下36℃±1℃培養(yǎng)48h后，所得的細(xì)菌菌落總數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)為<100CUF/ml。檢測(cè)的接種技術(shù)指定為傾注培養(yǎng)法。

（2）YY 0572-2015《血液透析及相關(guān)治療用水》已開始關(guān)注環(huán)境污染菌的檢測(cè)，要求采用常規(guī)的微生物檢測(cè)方法獲得細(xì)菌總數(shù)，首選薄膜過濾法，但不接受接種環(huán)法?？梢詤⒖疾捎谩吨腥A人民共和國(guó)藥典（二部）》（2010年版）中規(guī)定的方法，或培養(yǎng)基選用胰化蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基（TGEA）、R2A或其它確認(rèn)能提供相同結(jié)果的培養(yǎng)基，不能使用血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基，推薦17℃~23℃、168h（7d），針對(duì)環(huán)境菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

（3）我國(guó)和歐洲飲用水微生物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)比較，兩者飲用水參照限值標(biāo)準(zhǔn)不同，美國(guó)EPA標(biāo)準(zhǔn)是<500CFU/ml，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)是<100CFU/ml。主要區(qū)別在于我國(guó)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂（PCA），37℃培養(yǎng)2天，考慮的是檢出人體污染菌；而歐洲標(biāo)準(zhǔn)使用R2A培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7天，更多考慮環(huán)境污染菌。

（4）R2A培養(yǎng)基監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)：

R2A培養(yǎng)基有低營(yíng)養(yǎng)，碳源豐富的特點(diǎn)；與營(yíng)養(yǎng)瓊脂相比，更容易培養(yǎng)出環(huán)境細(xì)菌。

有研究對(duì)13家制藥企業(yè)生產(chǎn)使用的制藥用水衛(wèi)生質(zhì)量檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，采用中國(guó)藥典規(guī)定的檢測(cè)技術(shù)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30~35℃，3d與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，23~28℃，5d，結(jié)果僅檢出1家企業(yè)制藥用水細(xì)菌超標(biāo)。而采用歐洲藥典的R2A培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件30~35℃，5d，則有5家企業(yè)的制藥用水細(xì)菌超標(biāo)。

低營(yíng)養(yǎng)（Low nutrition），但碳源豐富；低培養(yǎng)溫度（Low temperature），延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（Long time），被稱為水源菌“3L”微生物檢測(cè)策略。這種策略更適合城市飲用水中污染菌的培養(yǎng)。但是，如前所述，日常監(jiān)測(cè)仍然按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來采集和檢測(cè)飲用水，36℃，48h，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)。

水源性微生物采樣監(jiān)測(cè)步驟：

日常監(jiān)測(cè)時(shí)，可以先放水，再取樣。如口腔科手機(jī)水先放水1min，漱口水先放水3杯，再采樣50ml。

流調(diào)時(shí)，可以計(jì)算每段管路中水的體積，判斷采到的水是哪一段，進(jìn)行分段留取水標(biāo)本。

使用藍(lán)口瓶采樣，則將水樣過濾；無菌操作下將濾膜接種于平皿表面進(jìn)行培養(yǎng)。

取1ml水樣，加入傾注培養(yǎng)基；傾注培養(yǎng)基的缺點(diǎn)是細(xì)菌生長(zhǎng)于瓊脂中，無法進(jìn)行細(xì)菌鑒定。涂抹法培養(yǎng)的菌落在培養(yǎng)基表面便于鑒定。涂抹法至少應(yīng)250μL*4塊平皿，合計(jì)總數(shù)。

感悟

倪曉平教授通過詳細(xì)講解環(huán)境微生物標(biāo)本采集與檢測(cè)方法，讓我們更加認(rèn)識(shí)和領(lǐng)悟到：微生物檢測(cè)是考核院感的金標(biāo)準(zhǔn)。作為感控人關(guān)注日常消毒質(zhì)量的考核要執(zhí)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；減少常規(guī)環(huán)境表面細(xì)菌污染的監(jiān)測(cè)；在感染暴發(fā)流調(diào)時(shí)采用一切可用的手段；重視采樣用工具與培養(yǎng)技術(shù)的選擇一樣重要；分子實(shí)驗(yàn)的介入以提升循證等級(jí)。

一句話：重視與發(fā)展微生物技術(shù)，刻不容緩！

圖文：王小蝦