下呼吸道感染診斷：mNGS or tNGS？如何選擇？

基因組測(cè)序目前在下呼吸道感染性疾病的診斷中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，特別是對(duì)病原的檢測(cè)。

但是隨著宏基因組測(cè)序（mNGS）技術(shù)的廣泛應(yīng)用，臨床發(fā)現(xiàn)mNGS在針對(duì)真菌、分枝桿菌的測(cè)序工作中，其對(duì)“破壁技術(shù)”的要求較高，技術(shù)難度也較大。

此外，如何解讀mNGS報(bào)告，如何“猜測(cè)”出有效序列，下一步應(yīng)該如何去驗(yàn)證“猜測(cè)”，如何從大量的病原體中提取到目的核酸序列，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，似乎也成為了一個(gè)難題。

因此，靶向測(cè)序（tNGS）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。由于靶向測(cè)序（tNGS）靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)成本低且相對(duì)快速，其在結(jié)核及結(jié)核耐藥檢測(cè)、腦脊液病原體鑒定、早產(chǎn)兒下呼吸道感染的診斷等領(lǐng)域都有極高的價(jià)值。

那么，宏基因組測(cè)序（mNGS）與靶向測(cè)序（tNGS）在下呼吸道感染性疾病診斷過(guò)程中應(yīng)當(dāng)如何選擇，這兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和各自的局限性是什么，中日醫(yī)院國(guó)家呼吸醫(yī)學(xué)中心魯炳懷教授在本次講座中就為大家進(jìn)行了詳細(xì)的解讀。

一、mNGS技術(shù)的選擇與局限性

我們以下呼吸道感染為例，其病原類(lèi)別非常多，包括病毒、細(xì)菌、非典型病原體、真菌、分枝桿菌等。不同人群、不同季節(jié)、不同年齡階段，誘發(fā)疾病的病原是不一樣的。

而用常規(guī)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)方法，只能培養(yǎng)出一部分病原菌。也正是因?yàn)槌Ｒ?guī)微生物檢驗(yàn)的“不給力”，很多臨床醫(yī)生會(huì)選擇繞過(guò)臨床微生物室，選擇宏基因組測(cè)序（mNGS）。

目前看來(lái)， mNGS是一個(gè)非常特殊的技術(shù)，它可以對(duì)所有的病原進(jìn)行檢測(cè)。相對(duì)而言，通過(guò)mNGS對(duì)病毒進(jìn)行測(cè)序較為簡(jiǎn)單，技術(shù)上難度相對(duì)較小。但是針對(duì)真菌、分枝桿菌的測(cè)序工作，其對(duì)“破壁技術(shù)”的要求較高，技術(shù)難度也較大。

目前，免疫抑制人群數(shù)量的增加、侵襲性真菌?。↖FD）患者人數(shù)也不斷增加，給患者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

而隨著引起下呼吸道感染的侵襲性念珠菌、曲霉菌、毛霉菌、新型隱球菌、卡氏肺孢子菌、地方流行性真菌、罕見(jiàn)真菌等的檢出率越來(lái)越高，讓臨床醫(yī)生頭疼的問(wèn)題是很多患者做了mNGS后卻發(fā)現(xiàn)了三個(gè)甚至多個(gè)真菌、分枝桿菌的擴(kuò)增片段，難以明確診斷。

而如何解讀mNGS報(bào)告、如何“猜測(cè)”出有效序列、下一步應(yīng)該如何去驗(yàn)證“猜測(cè)”、如何結(jié)合患者的影像學(xué)結(jié)果和臨床癥狀調(diào)整用藥從而提高病原覆蓋率，似乎成為了臨床MDT或者會(huì)診的主旋律。

如何從大量的病原體中提取到目的核酸序列，從何保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，成為了一個(gè)難題。

在臨床診斷感染的時(shí)候，如果病原載量高，無(wú)論是傳統(tǒng)的微生物技術(shù)，還是宏基因組測(cè)序（mNGS）、靶向測(cè)序（tNGS）都是沒(méi)有什么問(wèn)題的?，F(xiàn)在的難題是當(dāng)病原載量較低時(shí)，mNGS檢測(cè)報(bào)告應(yīng)該怎么去分析和解讀。

mNGS另一個(gè)主要的問(wèn)題是為了提高靈敏度，降低了特異度。不同的公司之間結(jié)果可比性比較差，除非是病原載量比較多的時(shí)候才有一定的可比性。

當(dāng)病原量少的時(shí)候，不同的公司得到的結(jié)果是千差萬(wàn)別的。為了能夠檢出的病原量更多，一些特異性數(shù)據(jù)庫(kù)中也納入了非特異的片段，這樣導(dǎo)致了和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以后的結(jié)果，未必是特異的，更無(wú)法明確診斷。

因此建議，應(yīng)在普通庫(kù)的基礎(chǔ)上再建一個(gè)二級(jí)庫(kù)來(lái)標(biāo)定擴(kuò)增序列是否特異、結(jié)果是否可靠。以分枝桿菌屬的測(cè)序?yàn)槔?，分枝桿菌屬是一類(lèi)細(xì)長(zhǎng)略帶彎曲，有時(shí)呈分枝狀的桿菌，細(xì)胞壁還要大量脂質(zhì)。

現(xiàn)在很多患者感染新冠、流感后易混合細(xì)菌感染或繼發(fā)鳥(niǎo)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌的感染，需要鑒別診斷。而這類(lèi)患者的mNGS結(jié)果常出現(xiàn)鳥(niǎo)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌有2~3個(gè)序列的情況，難以判斷患者是否合并繼發(fā)感染了分枝桿菌。

二、“傳統(tǒng)顯微鏡涂片鏡檢與培養(yǎng)” VS 宏基因組測(cè)序（mNGS）

（一）顯微鏡涂片鏡檢：通過(guò)直觀的觀察，可見(jiàn)人體炎癥反應(yīng)的狀況，如白細(xì)胞聚集、吞噬情況，可以幫助臨床明確病原的存在，但是靈敏度不高。

（二）培養(yǎng)是感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但時(shí)間周期長(zhǎng)。培養(yǎng)出活的致病菌落是藥敏試驗(yàn)的前提：

隱球菌屬與曲霉菌相對(duì)毛霉菌容易培養(yǎng)；

分枝桿菌推薦采用液體培養(yǎng)的手段，可提高陽(yáng)性率，縮短報(bào)告時(shí)間。

在所有感染性疾病中，超過(guò)30%的呼吸道感染、超過(guò)40%~50%血流感染、以及超過(guò)50%~60%腦炎和腦膜炎，通過(guò)傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)手段（直接檢查、抗原檢測(cè)、PCR、分離與培養(yǎng)）無(wú)法鑒別其病原體。

微生物培養(yǎng)可以分離的常見(jiàn)病原體

微生物培養(yǎng)可以分離的常見(jiàn)病原體.jpg

（三）宏基因組測(cè)序（mNGS）的靶標(biāo)是核酸，可報(bào)告耐藥基因

碳青霉烯酶耐藥基因（對(duì)于腸桿菌目細(xì)菌）；

mecA基因（對(duì)于葡萄球菌）；

結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因等。

從傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)的角度來(lái)解讀mNGS的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mNGS被“擴(kuò)大化”了，我們需要一種方法去校準(zhǔn)mNGS的結(jié)果，判斷其是否可靠。而如果醫(yī)院的基礎(chǔ)微生物檢測(cè)能力比較弱，就很難解決這個(gè)問(wèn)題。

在 mNGS 應(yīng)用的背景下，傳統(tǒng)微生物檢測(cè)應(yīng)該如何發(fā)展、如何去建設(shè)，如何去增強(qiáng)是重點(diǎn)，而不是削弱。很多歐美國(guó)家mNGS并沒(méi)有完全鋪開(kāi)，但是他們的診療工作卻開(kāi)展的很好。從這個(gè)角度分析，基礎(chǔ)的微生物檢測(cè)能力是非常重要的。

mNGS加深了人們對(duì)鸚鵡熱衣原體、人皰疹病毒（1~8型）、鉤端螺旋體、少見(jiàn)NTM與隱球菌等病原體的認(rèn)識(shí)。但是數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的結(jié)果是否可靠、是否是病原體，如果是病原體是否需要治療，是否達(dá)到感染的標(biāo)準(zhǔn)，還需要更深入的探討。

往往更需要和傳統(tǒng)方法（常規(guī)微生物鏡檢與培養(yǎng)、組織病理染色、影像學(xué)等）相結(jié)合。

三、靶向測(cè)序（tNGS）

靶向測(cè)序（tNGS）基于超多重PCR技術(shù)，可進(jìn)行靶向病原檢測(cè)，突破病原檢測(cè)的局限性。

（一）特異性增加目標(biāo)病原體核酸序列數(shù)和比例，提高目標(biāo)微生物的支持reads數(shù)和覆蓋度，保證難檢/苛養(yǎng)/低載量病原的檢出。

（二）毒力基因的檢測(cè)：為區(qū)分致病菌和定植菌提高基礎(chǔ)。

（三）耐藥基因的檢測(cè)：與致病病原、耐藥表型相合。

由于靶向測(cè)序（tNGS）靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢測(cè)成本低且相對(duì)快速，其在結(jié)核及結(jié)核耐藥檢測(cè)、腦脊液病原體鑒定、早產(chǎn)兒下呼吸道感染的診斷等領(lǐng)域都有極高的價(jià)值。靶向測(cè)序（tNGS）代表了很重要的一個(gè)發(fā)展方向，特別是對(duì)無(wú)需檢測(cè)過(guò)多病原體的患者。

四、宏基因組測(cè)序（mNGS）與靶向測(cè)序（tNGS）的選擇

（一）mNGS在發(fā)熱待查、不明原因感染或發(fā)熱、排除感染以及對(duì)罕見(jiàn)、疑難、反復(fù)、慢性感染的診斷有很大的幫助

（二）tNGS可以針對(duì)基層群體/常見(jiàn)感染患者的常規(guī)檢測(cè)手段，包括但不限于各種系統(tǒng)社區(qū)獲得性感染、醫(yī)院獲得性感染等。

超多重PCR（正向富集）+高通量測(cè)序（NGS）的靶向測(cè)序（tNGS）技術(shù)可以滿(mǎn)足98%臨床應(yīng)用場(chǎng)景，可以實(shí)現(xiàn)DNA和RNA共檢，無(wú)需分開(kāi)送檢。

具有快（實(shí)驗(yàn)TAT最快12h）、敏（敏感度優(yōu)于mNGS）、廉（高性?xún)r(jià)比）、定（病原精確定量）的特點(diǎn)。

（三）下呼吸道感染需要綜合診斷

下呼吸道感染需結(jié)合實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)、影像學(xué)、臨床癥狀、病理學(xué)以及生物標(biāo)記物和急性相炎癥反應(yīng)指標(biāo)等綜合診斷。

而mNGS/tNGS/多重分子檢測(cè)的未來(lái)我們認(rèn)為：

＜10個(gè)靶標(biāo)、小panel，可使用熒光PCR技術(shù)（Gene Xpert）；

10-50 個(gè)靶標(biāo)、中小panel，可使用微流控POCT（Filmarry）；

200-1000個(gè)靶標(biāo)、中panel，可使用panel tNGS；

無(wú)預(yù)定靶標(biāo)、大panel，可使用mNGS。