一文講清，幾種PCR有什么區(qū)別

在平常學習和生活過程中，我們常會遇到各種PCR叫法，包括PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR，很多人往往難以弄清楚這幾種PCR有什么區(qū)別。下面簡單的介紹一下這幾種PCR之間的區(qū)別。

一、PCR是什么？

PCR是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是美國科學家Kary B. Mullis1985年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復制出上百萬份的DNA拷貝。Mullis 因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。PCR技術(shù)自問世以來，在生物科學領(lǐng)域、分子診斷領(lǐng)域、親子鑒定、法醫(yī)鑒定以及犯罪調(diào)查等方面發(fā)揮了巨大作用，是迄今為止最為重要的技術(shù)之一。經(jīng)過演化和革新，PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了三代：普通PCR、實時熒光定量PCR（qPCR）以及數(shù)字PCR（dPCR）。

二、PCR的原理及步驟

PCR的基本原理與DNA在體內(nèi)復制相似，特異性主要依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火和延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：DNA模板經(jīng)過高溫（95℃左右）加熱一段時間后，解離成單鏈，以便能夠與引物結(jié)合；

②DNA模板與引物的退火（復性）：將溫度降至55℃左右時，引物與模板DNA單鏈按堿基互補配對的原則互相結(jié)合；

③引物的延伸：再將溫度調(diào)至72℃左右（DNA聚合酶最適反應溫度），DNA模板和引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，按堿基配對與半保留復制原理，沿著5'→3'的方向合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。經(jīng)過變性、退火和延伸重復若干個循環(huán)后，就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、PCR的分類

1.普通 PCR

普通PCR即第一代PCR，普通PCR擴增儀即可擴增靶基因，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行定性分析。

2.實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）

實時熒光定量PCR，即Real-Time PCR，即第二代PCR，是指在PCR擴增反應體系中加入熒光染料或者熒光基團，在整個PCR反應過程中通過收集熒光信號來實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產(chǎn)物量的變化，最后通過CT值和標準曲線對待測檢測樣品進行定量分析。qPCR在聚合酶鏈反應“變性一退火一延伸”擴增過程的“延伸”段，對熒光探針標記的靶基因熒光信號進行實時采集，通過3個參數(shù)(熒光信號-Ct值-靶基因的起始濃度)間的關(guān)系，最終確定靶基因的拷貝數(shù)或基因的表達水平。

實時熒光定量PCR 極大地擴展了PCR 技術(shù)在整個生命科學的研究與應用，例如，感染性疾病、腫瘤遺傳性疾病、移植配型、個性化用藥等眾多醫(yī)學領(lǐng)域。尤其是在臨床醫(yī)學檢驗和食品安全檢測等領(lǐng)域迅速發(fā)展，成為許多病原微生物診斷的金標準。但由于定量 PCR 的絕對定量分析結(jié)果最終依賴于 Ct 值和標準曲線，這是其最大的技術(shù)瓶頸，所以在某種意義上所謂的“定量”也只是相對的。而且在低拷貝靶基因分子模板濃度差異細微的條件下其檢測靈敏度、精確度和分辨率都受到了限制。

qPCR常用的熒光主要有兩種：TaqMan探針法和SYBR Green法。

①熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：

TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中最常用的檢測方法。Taqman探針是最為常用的一種水解探針，在探針的5’端存在一個熒光基團，通常為FAM，探針本身則為一段與目的基因互補的序列，在探針的3’端有一個熒光猝滅基團，根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理(F?rster resonance energy transfer， FRET)，當報告熒光基團（供體熒光分子）和猝滅熒光基團（受體熒光分子）激發(fā)光譜重疊且距離很近時（7-10nm），供體分子的激發(fā)可以誘發(fā)受體分子發(fā)熒光，而自身熒光減弱。所以PCR反應開始，探針游離于體系中完整存在時，報告熒光基團并不會發(fā)出熒光，當退火時，引物和探針結(jié)合于模板，在延伸階段，聚合酶不斷的合成新鏈，由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，到達探針時，DNA聚合酶就會將探針從模板上水解下來，報告熒光基團和猝滅熒光基團分開，釋放熒光信號。由于探針和模板存在一對一的關(guān)系，所以在試驗的精度和靈敏度上，探針法都要優(yōu)于染料法。每擴增一條DNA，就形成一個熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號累積的越多，熒光強度越大。

優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高；適合進行多重qPCR檢測；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本。

缺點：需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性，定量時容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，本底較高；檢測結(jié)果很難判斷實際的擴增特性。

②熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中最常用的熒光染料，它能夠與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號。因此，反應中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會隨著產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

優(yōu)點：價格相對較低；使用方便；對DNA模板沒有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。

缺點：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，需要通過熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應體系以降低非特異性擴增；不適合進行多重qPCR檢測。

注：多重PCR，也稱多重引物PCR或復合PCR，是在一個反應體系中加入兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的一種新型PCR擴增技術(shù)。

3.數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）

數(shù)字PCR即第三代PCR，即絕對定量PCR。與傳統(tǒng)技術(shù)不同，基于泊松分布原理，數(shù)字 PCR 技術(shù)將 DNA 或RNA 樣品分散成大量的微反應單元（納升級）中，然后對眾多微反應單元內(nèi)的靶序列進行單分子模板 PCR 擴增、熒光檢測和統(tǒng)計學分析，實現(xiàn)絕對定量，不依賴于標準曲線和已知濃度的多個梯度標準品，直接檢測樣品中核酸的原始濃度。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)熒光定量 PCR 更加出色的靈敏度和精確性，數(shù)字 PCR 迅速得到廣泛的關(guān)注，尤其在痕量核酸樣本檢測、復雜背景下稀有突變檢測、核酸拷貝數(shù)變異和基因表達量微小差異鑒定方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可。

4. 逆轉(zhuǎn)錄PCR（ Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR）

逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補DNA（cDNA）稱作“逆轉(zhuǎn)錄”，由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后，DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴DNA的DNA聚合酶完成，隨每個循環(huán)倍增，即通常的PCR。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR技術(shù)靈敏且應用廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通過一步法或兩步法進行，一步法是RT反應和PCR反應在同一試管中進行；而在兩步法中兩個反應是分開依次進行的。

5.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR, RT-qPCR）

Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合，其中的“RT”是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR，即以mRNA或總RNA為模板，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進行定量檢測分析。因為RT-PCR只可以定性，但不能進行定量分析。與RT-PCR一樣，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進行，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進行。

四、結(jié)語

1、PCR，通常指的是普通PCR（一代），以雙鏈DNA為模板，以dNTP為底物進行擴增，進行定性擴增雙鏈DNA。

2、qPCR（Real-time PCR），指的是實時熒光定量PCR，以DNA為模板，以dNTP為底物，對擴增出的DNA進行定量分析。

3、dPCR（數(shù)字PCR），以DNA為模板，進行PCR擴增，不依賴于ct值和標準曲線，實現(xiàn)PCR的絕對定量。

4、RT-PCR，指的是逆轉(zhuǎn)錄PCR，由mRNA逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，以dNTP為底物，進行DNA的擴增，屬于PCR的變種，結(jié)果只能定性，不能定量。

5、RT-qPCR，指的是實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，是qPCR+RT-PCR的組合，將總RNA或mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后再作為模板，以dNTP為底物，進行qPCR的定量分析。

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