呼吸道感染的病原學(xué)診斷方法

一、呼吸道病原學(xué)檢測標本的采集方法

病原學(xué)檢測標本的采集方法可分為非侵入性和侵入性,前者創(chuàng)傷小，患者易于接受，但容易受到上呼吸道定植菌群的污染；后者為有創(chuàng)性操作，從生理狀態(tài)下"相對無菌"的部位取材，對診斷意義更大，其中組織活檢標本是診斷肺部感染性疾病的金標準。應(yīng)根據(jù)患者的臨床情況選擇最有效的采集方法，首先選擇非侵入性方法（無創(chuàng)或微創(chuàng)檢查），在非侵入性方法不能確診時，在高度疑診的情況下選擇有創(chuàng)檢查方法。應(yīng)對標本采集者進行培訓(xùn)，并對所采集的標本進行質(zhì)量控制，以提高標本的質(zhì)量，減少假陽性和假陰性結(jié)果。

二、標本的運送、儲存與預(yù)處理

1．標本運送和儲存原則：

（1）標本標簽準確且申請單信息完整，應(yīng)將標簽貼在容器上，而非容器蓋上[13,14]；（2）嚴格無菌操作[7]；（3）盡快送檢標本，應(yīng)在采樣后2 h內(nèi)送達實驗室，樣本量少的標本應(yīng)于30 min內(nèi)送檢，避免標本干涸[7,15]；（4）對一些特定的病原體，應(yīng)選擇合適的方法對標本進行保存和運送，并及時進行檢測。

2．針對不同病原體的檢測方法：

標本采集后應(yīng)及時進行質(zhì)量控制，合格的標本應(yīng)盡可能短期內(nèi)送檢。在臨床工作中，除了常規(guī)檢驗外，還應(yīng)結(jié)合患者的病史、臨床表現(xiàn)、化驗結(jié)果和影像學(xué)檢查，有針對性地選擇合適的檢測方法對某些病原體進行檢測。當臨床預(yù)期和檢測結(jié)果不相符時，應(yīng)注意排除標本保存不當和檢測方法選擇錯誤等方面的因素。

三、呼吸道病原檢測方法的優(yōu)缺點

不同檢驗方法的優(yōu)缺點見表5[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29]。在病原體培養(yǎng)和分離之后，對其進行體外藥敏試驗有助于進行針對性抗感染治療。目前測定藥物敏感度的方法主要有傳統(tǒng)的藥敏試驗、自動化檢測方法和分子生物學(xué)方法[30]。傳統(tǒng)的藥敏試驗方法是表型體外試驗，可直接測量細菌對抗菌藥物的敏感度。自動化檢測技術(shù)是在抗菌藥物存在的情況下對細菌生長進行光學(xué)測定，通量高，比傳統(tǒng)方法更加快速。也可以利用PCR等分子生物學(xué)方法直接對耐藥基因進行檢測，由于大多數(shù)細菌的耐藥機制與多種因素相關(guān)，其基因型與表型通常并不完全相同，選擇抗菌藥物需綜合分析決策。

四、病原檢測結(jié)果的判讀及其臨床價值

病原學(xué)檢查結(jié)果對臨床治療策略的選擇具有指導(dǎo)意義，陰性結(jié)果有助于判斷是否停用抗菌藥物。病原學(xué)檢查結(jié)果的判讀應(yīng)該綜合考慮患者的年齡、基礎(chǔ)疾病、免疫狀態(tài)、臨床特點、病情嚴重程度以及先期的抗感染治療等情況。

（一）直接抗原快速檢測

膠體金法病毒抗原快速檢測方法簡便、快速、成本低，與實時逆轉(zhuǎn)錄PCR比較，流感病毒抗原快速檢測的敏感度為48.9%~59.8%，特異度為99.2%~99.7%[311:呼吸道合胞病毒抗原快速檢測的敏感度為90%，特異度為98.8%[321,提示病毒抗原快速檢測的特異性較好，但存在敏感度低、假陰性率較高的問題，這與鼻咽拭子標本病毒含量不穩(wěn)定以及膠體金方法的敏感度較低有關(guān)[33]。故當臨床高度懷疑為病毒感染，但病毒快速檢測結(jié)果為陰性時，應(yīng)加做病毒核酸檢測，以排查假陰性[34]

除病毒外，抗原快速檢測還可用于對真菌抗原(1,3-B-D-葡聚糖試驗、半乳甘露聚糖試驗)、細菌抗原(尿肺炎鏈球菌抗原)和非典型致病原抗原(尿嗜肺軍團菌抗原)等的檢測。和抗體檢測不同抗原檢測不受機體免疫狀態(tài)的影響，但可能與藥物和治療方案有關(guān)，出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果，在臨床工作中應(yīng)結(jié)合患者的實際情況進行仔細分析。

（二）血清特異性抗體檢測

某些致病的病原體在培養(yǎng)時所需條件高，生長周期長，陽性檢出率低，檢測特異性抗體在一定程度上可彌補這些不足。流感病毒、病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、嗜肺軍團菌、肺炎支原體肺炎衣原體和結(jié)核分枝桿菌等病原體均有商用的抗體檢測試劑盒對新型冠狀病毒肺炎患者的檢測也發(fā)現(xiàn)，在感染后3~5 d即可檢測到病毒特異性IqM，而lgG抗體滴度在恢復(fù)期較急性期有4倍以上升高[35]。檢測這些病原抗體具有速度快、特異度較高的特點，適合在門診、急診或基層醫(yī)院用于病原體的篩查。但由于早期陽性率較低，需要采集急性期及恢復(fù)期雙份血清進行檢測和效果評價，但體液免疫缺陷的患者可呈假陰性。

（三）涂片

所獲取的各種標本均應(yīng)行病原學(xué)涂片檢查。非侵入性檢查獲得的標本必須為合格標本，不合格標本常存在上呼吸道定植菌污染。在結(jié)果判讀時，需要結(jié)合患者的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)，排除操作過程或環(huán)境污染的可能。BALF離心沉淀后行六胺銀染色、抗酸染色和革蘭染色可分別用來檢測肺孢子菌、分枝桿菌和部分細菌等。肺穿刺標本和胸腔積液涂片發(fā)現(xiàn)病原體對確診具有重要意義。

1．細菌：

(1)合格下呼吸道標本鏡檢可見典型革蘭陽性柳葉刀樣雙球菌，如果每個油鏡視野中肺炎鏈球菌超過10個對診斷有參考意義[36];分離到支氣管炎博德特菌、土拉熱弗朗西斯菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌可以作為確診依據(jù)[371:

(2)經(jīng)氣管導(dǎo)管吸引分泌物涂片革蘭染色，若每個高倍鏡視野檢出2%以上白細胞有微生物吞現(xiàn)象，對病原學(xué)診斷有參考價值，可作為初始經(jīng)驗性抗感染治療的依據(jù)[38,39,40,41,42,43];

(3)合格下呼吸道標本涂片鏡檢與培養(yǎng)結(jié)果一致(如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌等)對診斷有重要參考意義[37];

(4)弱抗酸染色有助于奴卡菌的快影。

2．分枝桿菌：

痰涂片萋-尼抗酸染色和熒光染色法是診斷開放性肺結(jié)核的主要手段，但涂片鏡檢所見的抗酸桿菌并不能區(qū)別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，熒光涂片鏡檢的敏感度高于萋-尼染色[44]。

3．真菌：

呼吸道標本涂片發(fā)現(xiàn)真菌孢子或菌絲時，應(yīng)結(jié)合患者的臨床特征，基礎(chǔ)疾病、免疫狀態(tài)及其他標本病原學(xué)檢查結(jié)果綜合判斷是定植還是感染。念珠菌是口腔常見的定植菌,涂片發(fā)現(xiàn)念珠菌假菌絲和出芽孢子時應(yīng)排除口腔局部定植或感染[45]。

呼吸道標本發(fā)現(xiàn)曲霉或毛霉絲時臨床意義較大，合格痰標本、氣管內(nèi)吸引物、BALF或刷檢標本鏡檢發(fā)現(xiàn)較為特異的菌絲可作為診斷肺曲霉病、毛病的微生物學(xué)依據(jù)，但涂片陽性率遠低于培養(yǎng)陽性率[36,46]。

檢測肺孢子菌最常用的是六胺銀染色和免疫熒光染色法，BALF或誘導(dǎo)痰鏡檢發(fā)現(xiàn)病原體可作為肺孢子菌肺炎的確診依據(jù)。黏蛋白卡紅染色可用于發(fā)現(xiàn)隱球菌，但不能作為隱球菌肺炎的診斷依據(jù)。下呼吸道標本涂片相差顯微鏡鏡檢是診斷皮炎芽生菌肺炎、粗球孢子菌肺炎、新型隱球菌肺炎及曲霉肺炎的重要手段之一?？傊鄬φ婢囵B(yǎng)而言，涂片檢查是對真菌感的快速、初步、有效的診斷方法[3℃」

4．寄生蟲：

涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)寄生蟲蟲體、蟲卵、滋養(yǎng)體、包囊或卵囊可作為確診依據(jù)。直接涂片鏡檢可發(fā)現(xiàn)并殖吸蟲蟲卵、阿米巴原蟲滋養(yǎng)體，吉姆薩染色可發(fā)現(xiàn)剛地弓形蟲滋養(yǎng)體或包囊，改良抗酸染色可發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲卵囊，改良三色染色法可發(fā)現(xiàn)比氏微孢子蟲[13,47]。

（四）培養(yǎng)

在進行痰培養(yǎng)前必須確定是合格痰標本，并排除操作不當或環(huán)境污染的情況。定量培養(yǎng)有助于區(qū)分致病菌和定植菌。

1．細菌：

（1）痰定量培養(yǎng)的細菌濃度≥107 cfu/ml、經(jīng)氣管內(nèi)吸取物細菌培養(yǎng)濃度≥105 cfu/ml、BALF培養(yǎng)細菌濃度≥104 cfu/ml或保護性毛刷標本細菌培養(yǎng)濃度≥103 cfu/ml時，致病菌的可能性較大[48,49,50]；

（2）胸腔積液、肺活檢標本培養(yǎng)到病原菌[13]，下呼吸道標本培養(yǎng)出支氣管炎博德特菌、土拉熱弗朗西斯菌、鼠疫耶爾森菌、炭疽芽胞桿菌可作為確診依據(jù)[37]。

2．分枝桿菌：

培養(yǎng)結(jié)果可鑒別結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，并有利于體外藥敏試驗。但結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)耗時長、操作復(fù)雜，對實驗室生物安全要求較高，應(yīng)結(jié)合核酸檢測如GeneXpert檢測結(jié)果進行判斷[44,51]。

3．非典型病原體：

下呼吸道標本分離培養(yǎng)陽性可以確診，但耗時長，陽性率偏低，通常通過血清特異性抗體、核酸檢測等方法診斷。

4．呼吸道病毒：

標本進行細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)或培養(yǎng)細胞表面出現(xiàn)血細胞凝集抗原提示病毒陽性。但因其培養(yǎng)耗時長，陽性率偏低，不建議常規(guī)應(yīng)用，多通過血清特異性抗體、核酸檢測等方法診斷[36]。

5．真菌：

肺組織活檢標本培養(yǎng)陽性是診斷真菌感染的重要依據(jù)，但應(yīng)注意排除污染的可能。即使是下呼吸道分泌物、BALF也需除外定植或污染。痰培養(yǎng)念珠菌陽性難以區(qū)分定植或感染,臨床意義有限,即使保護毛刷標本培養(yǎng)陽性也不能作為診斷侵襲性肺念珠菌病的依據(jù)，但如果痰、誘導(dǎo)痰或BALF標本鏡檢時發(fā)現(xiàn)大量出芽菌體和念珠菌菌絲提示念珠菌處于快速繁殖期，具有一定的臨床指導(dǎo)意義[45]。

痰標本培養(yǎng)連續(xù)2次分離到同種曲霉及BALF單次培養(yǎng)陽性可作為診斷肺曲霉病的微生物學(xué)依據(jù)[52]。

[隱球菌培養(yǎng)陽性可以作為診斷的重要參考依據(jù)，由于新型隱球菌可以寄生于健康人群,應(yīng)結(jié)合臨床具體情況判斷是否為感染，對人免疫缺陷綜合征或其他免疫抑制患者有參考價值[45,53]。

目前肺組織胞漿菌病確診標準應(yīng)為組織學(xué)和微生物學(xué)檢查同時發(fā)現(xiàn)該菌[53]。

臨床標本分離培養(yǎng)出馬爾尼菲青霉是診斷該病會診的金標準[54]。

（五）核酸分子擴增檢測和基因芯片檢測

與傳統(tǒng)方法相比較，核酸分子擴增和基因芯片檢測具有以下優(yōu)勢：

（1）方法簡單、快速、高效，敏感度和特異度均較高，能為臨床早期診斷提供依據(jù)，尤其對一些需要長時間培養(yǎng)（如結(jié)核分枝桿菌）或無法體外培養(yǎng)（如病毒）的病原體，更適合采用分子診斷技術(shù)進行檢測。在新近發(fā)生的新型冠狀病毒肺炎疫情中，實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性已經(jīng)作為確診病例的病原學(xué)診斷標準之一[35,54]。（2）目前的分子診斷技術(shù)可以一次性檢測多種病原體，有助于快速篩查病原。

（3）目前研發(fā)的耐藥基因檢測有助于制定臨床決策[55,56,57]。

但分子檢測技術(shù)也存在不足：

（1）多重PCR使用多對引物同時擴增時，可能出現(xiàn)引物間相互干擾，影響其敏感度和特異度，造成假陰性或假陽性；

（2）核酸檢測陽性結(jié)果需結(jié)合臨床實際情況，分析究竟是定植菌還是致病菌。

目前，我國自主研發(fā)的環(huán)引物介導(dǎo)的等溫擴增微流控芯片體系，有機結(jié)合了核酸分子擴增和基因芯片技術(shù)，應(yīng)用加樣后自動封閉式的獨立分隔多重擴增，在提高診斷率的同時，降低和避免了常規(guī)核酸擴增引起污染的可能，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床病原的檢測[58]。