新冠病毒變異株在干燥拭子存儲(chǔ)后的存活與檢測(cè)

來(lái)源：南非約翰內(nèi)斯堡威特沃特斯蘭德大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)結(jié)核病研究卓越中心，科學(xué)與創(chuàng)新部/國(guó)家研究基金會(huì)，國(guó)家健康實(shí)驗(yàn)室服務(wù)。

COVID-19自2019年嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）大流行開(kāi)始以來(lái)，已導(dǎo)致近5.98億人感染和超過(guò)646萬(wàn)人死亡。大流行的迅速爆發(fā)，加上病毒變種的出現(xiàn)，嚴(yán)重削弱了許多衛(wèi)生系統(tǒng)，特別是在應(yīng)對(duì)大量診斷負(fù)荷的能力方面。診斷試劑盒和能力的短缺迫使實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存臨床樣本，導(dǎo)致了巨大的積壓，這對(duì)診斷結(jié)果的影響尚未完全了解。在此，我們研究了在7天內(nèi)儲(chǔ)存SARS-CoV-2接種的干拭子對(duì)四種病毒株的檢測(cè)和活力的影響。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)的病毒載量在此期間對(duì)所有測(cè)試的病毒載量顯示沒(méi)有顯著降解。相反，通過(guò)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID）測(cè)定，病毒活力減少了約2個(gè)對(duì)數(shù)，在干拭子上經(jīng)過(guò)7天后檢測(cè)到1-3個(gè)對(duì)數(shù)的活病毒。當(dāng)用102個(gè)病毒拷貝的Omicron變種涂覆拭子時(shí)，在4°C或室溫下儲(chǔ)存24小時(shí)后未檢測(cè)到活病毒。然而，在7天內(nèi)沒(méi)有喪失PCR信號(hào)。所有四種病毒株在Vero E6細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)顯示出相似的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和存活能力。我們的數(shù)據(jù)提供了關(guān)于臨床環(huán)境中儲(chǔ)存拭子上SARS-CoV-2活力的信息，對(duì)診斷結(jié)果的獲取和實(shí)驗(yàn)室處理協(xié)議具有重要意義。高病毒載量的SARS-CoV-2株在拭子上存活7天可能會(huì)影響公共衛(wèi)生和診斷實(shí)驗(yàn)室的生物安全實(shí)踐。

引言
冠狀病毒?。–OVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合癥冠狀病毒2型（SARS-CoV-2）引起的，首次報(bào)告于2019年12月31日在中國(guó)湖北省武漢市（Zhu et al., 2020）。最初，SARS-CoV-2感染的患者表現(xiàn)出不同程度的疾病嚴(yán)重性，從無(wú)癥狀感染（1%）到嚴(yán)重呼吸疾?。?0%）和致死率（2-3%）（Bai et al., 2020; Chan et al., 2020; Wu and Mcgoogan, 2020）。幾周內(nèi)，COVID-19傳播至全球，導(dǎo)致世界衛(wèi)生組織（WHO）宣布其為全球大流行（WHO, 2020）。SARS-CoV-2主要通過(guò)呼吸道分泌物或飛沫的密切接觸傳播（WHO, 2020）。然而，有證據(jù)表明通過(guò)接觸病毒污染的表面和手也可以間接傳播（Marques and Domingo, 2021）。SARS-CoV-2能夠在不同表面上存活較長(zhǎng)時(shí)間，存活時(shí)間從幾天到幾個(gè)月不等，具體取決于環(huán)境溫度（Sun et al., 2020; Sun et al., 2022）。

疾病的快速傳播和進(jìn)展要求進(jìn)行高通量檢測(cè)，以管理和控制傳播。這導(dǎo)致了樣本檢測(cè)的積壓，特別是在資源有限的環(huán)境中，因財(cái)務(wù)資源、人力和檢測(cè)試劑盒的獲取不均而受到影響。因此，臨床拭子樣本不得不在檢測(cè)前存儲(chǔ)較長(zhǎng)時(shí)間。在某些情況下，特別是在公共衛(wèi)生檢測(cè)設(shè)施中，儲(chǔ)存的標(biāo)本被銷毀，以試圖在最佳利用可用檢測(cè)試劑盒和因長(zhǎng)期儲(chǔ)存而獲得陰性結(jié)果之間取得平衡。這迫使實(shí)驗(yàn)室和制造商探索替代的樣本收集和運(yùn)輸方式（Rogers et al., 2020）。為了調(diào)查儲(chǔ)存的診斷影響，最近的一項(xiàng)研究顯示，SARS-CoV-2鼻咽拭子的延長(zhǎng)（21天）儲(chǔ)存不會(huì)對(duì)三種不同分子平臺(tái)的基因組材料回收產(chǎn)生負(fù)面影響（Skalina et al., 2022）。另一項(xiàng)研究表明，干拭子的運(yùn)輸后再水合，使用三種不同的介質(zhì)（UTM、VTM和生理鹽水），與在運(yùn)輸介質(zhì)中收集的拭子相比，病毒RNA的回收沒(méi)有差異（Parikh et al., 2021）。雖然這些數(shù)據(jù)表明儲(chǔ)存的干拭子保留了診斷價(jià)值，但它們并未評(píng)估病毒的可培養(yǎng)性。先前的研究表明，臨床標(biāo)本中病毒拷貝數(shù)與活力之間存在強(qiáng)相關(guān)性，但沒(méi)有報(bào)告時(shí)間數(shù)據(jù)（Huang et al., 2020）。

在此，我們研究了干拭子儲(chǔ)存7天對(duì)不同SARS-CoV-2病毒株的回收和活力的影響。我們還調(diào)查了變種在干拭子上的生存情況是否存在差異。我們的數(shù)據(jù)表明，儲(chǔ)存7天并未影響檢測(cè)基因組材料的能力。然而，在同一期間，病毒的活力下降了2個(gè)對(duì)數(shù)，殘余活病毒的檢測(cè)水平高達(dá)3個(gè)對(duì)數(shù)。

材料與方法
所有方法均按照維特沃特斯蘭德大學(xué)生物安全委員會(huì)批準(zhǔn)的相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行（批準(zhǔn)編號(hào)：20200502Lab）。所有實(shí)驗(yàn)均在南非農(nóng)業(yè)、林業(yè)和漁業(yè)部注冊(cè)的生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行（注冊(cè)編號(hào)：39.2/NHLS-20/010）。

猴子 Vero E6 細(xì)胞系的培養(yǎng)條件

貼壁的猴子 Vero E6 細(xì)胞在完全的 DMEM 中培養(yǎng)和維持，該培養(yǎng)基通過(guò)將 45 毫升含 L-谷氨酰胺的杜爾貝克改良鷹培養(yǎng)基（DMEM）與 5 毫升胎牛血清（FBS）和 50 μg/ml 的慶大霉素混合制備而成。將來(lái)自液氮的 Vero E6 細(xì)胞的冷凍小瓶迅速解凍（約 2 分鐘），并在 37°C 的水浴中輕輕搖動(dòng)。解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有 9.0 毫升完全 DMEM 的 50 毫升離心管中，以 125 x g 的速度離心 5 分鐘。棄去上清液后，將沉淀重懸于殘余培養(yǎng)基中，并加入到一個(gè)含有 10 毫升預(yù)熱完全 DMEM 的 25 cm2（T25）培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞在 37°C、5% CO? 的條件下培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到 70-80% 的融合度。當(dāng)需要時(shí)，每 2 到 3 天更換一次培養(yǎng)基，通過(guò)丟棄培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基并替換為新鮮的完全 DMEM。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需的融合度（>80%）時(shí)，去除舊培養(yǎng)基，用 5 毫升 TripleX（Gibco）處理 10-15 分鐘（37°C）。從培養(yǎng)瓶表面脫落的細(xì)胞平均分配到兩個(gè) 75 cm2（T75）培養(yǎng)瓶中，并按照上述方法繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求以這種方式擴(kuò)增細(xì)胞。

SARS-CoV-2 病毒滴度的擴(kuò)增

來(lái)自南非的四種 SARS-CoV-2 毒株的擴(kuò)增，分別為武漢毒株（由斯坦陵布什大學(xué)提供的病毒上清液）和從國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室及南非傳染病國(guó)家研究所獲得的殘余去標(biāo)識(shí)臨床拭子中分離的 Beta、Delta 和 Omicron 毒株（倫理審查編號(hào) M1911201）。將冷凍樣本的運(yùn)輸介質(zhì)解凍后，通過(guò) 0.45 μM 過(guò)濾器過(guò)濾，然后將 250 μl 的相應(yīng)上清液接種到預(yù)先接種了 1.2 x 10^6 Vero E6 細(xì)胞的 24 孔微孔板的每個(gè)孔中，感染 1 小時(shí)。感染后，每個(gè)孔中加入 250 μl 完全 DMEM，并在 CO? 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3-4 天。每日監(jiān)測(cè)細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），當(dāng)大約 80% 的細(xì)胞從培養(yǎng)孔底部脫落時(shí)，收集上清液。從每個(gè)樣本中取出 150 μl 上清液進(jìn)行 RNA 提取，其余上清液在 BSL3 實(shí)驗(yàn)室的 -80°C 冷凍保存。使用實(shí)時(shí) RT-qPCR 定量病毒拷貝數(shù)，拷貝數(shù)達(dá)到 10^6 的樣本通過(guò)將 250 μl 的相應(yīng)冷凍病毒樣本接種到接種了 10 ml、3 x 10^6 Vero E6 細(xì)胞的 T75 培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)增。3-4 天后，當(dāng) 80% 的細(xì)胞顯示 CPE 時(shí)，將培養(yǎng)基以 2500 x g 的速度在臺(tái)式離心機(jī)中離心 15 分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的 50 毫升管中，并分裝 1 ml 的樣本在 -80°C 冷凍保存。對(duì)于每種變異株，至少純化了三個(gè)或更多的分離物，除了 Beta 變異株，54 個(gè)篩選的分離物中僅有一個(gè)顯示出復(fù)制能力。

生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

本研究使用了武漢、Beta、Delta 和 Omicron（BA.1）毒株。使用中位組織培養(yǎng)感染劑量（TCID）法確定細(xì)胞活性。Vero E6 細(xì)胞以 1.2 x 10^5（2.5 ml）的濃度在 6 孔微孔板中以三重重復(fù)接種，每種毒株各自接種，培養(yǎng)過(guò)夜于 37°C。解凍的病毒樣本被解凍后，500 μl 用于感染三重孔中的細(xì)胞。感染 1 小時(shí)后，每個(gè)孔中加入 2.5 ml 完全 DMEM。通過(guò) TCID 法在 0、24、48 和 72 小時(shí)監(jiān)測(cè)病毒的生長(zhǎng)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過(guò) qRT-PCR 評(píng)估病毒載量，并報(bào)告為每 20 μl 反應(yīng)的拷貝數(shù)。為此，將 150 μl 上清液在 70°C 處理 5 分鐘，與 600 μl 裂解緩沖液混合，然后分析 300 μl 的上清液以實(shí)時(shí) TCID 法評(píng)估病毒的復(fù)制能力。

拭子的病毒涂覆

將各自的病毒株 aliquots（約 10^5 病毒拷貝，按 qRT-PCR 測(cè)定）解凍并在 DMEM 中稀釋十倍（10^5、10^4、10^3 和 10^2）。五個(gè) Copan eSwabs（Copan Italia S.p.A）分別浸入這些不同稀釋液中 10 秒，以實(shí)現(xiàn)高、中、低和非常低的病毒載量。對(duì)于 Delta 變異株，這允許在拭子上接種約 10^4 和 10^3 pfu/ml。對(duì)于 Omicron 變異株，此過(guò)程允許在拭子上接種 10^4、10^3 和 10^2 pfu/ml。接種后的拭子放入 15 毫升的 Falcon 管中，并在 4°C 下儲(chǔ)存 0 小時(shí)、24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)或 7 天。對(duì)于以 10^2 pfu/ml 接種的 Omicron 變異株，拭子也在室溫下儲(chǔ)存。

感染 Vero E6 細(xì)胞前從干拭子中回收病毒

病毒回收僅在 Delta 和 Omicron 變異株中進(jìn)行評(píng)估，因?yàn)檫@些是在研究期間流行的變異株。對(duì)這兩個(gè)變異株的每種稀釋液中各取一個(gè)拭子，立即（時(shí)間 0）評(píng)估，然后在 24 小時(shí)、48 小時(shí)、72 小時(shí)和 7 天后評(píng)估病毒的復(fù)制能力。將拭子放入 500 μl 不含 FCS 的 DMEM 中，放入 2 ml O 型環(huán)管中混合約 30 秒，以釋放拭子上的病毒。取出 150 μl 的培養(yǎng)基進(jìn)行 qRT-PCR 分析，300 μl 用于 TCID 法，如下所述。

TCID 法確定 SARS-CoV-2 的活性

將干拭子重懸的培養(yǎng)基稀釋 10 倍至 10^-5，每個(gè)稀釋液中取 250 μl 用于感染前一天接種的 Vero E6 細(xì)胞（1 x 10^5 細(xì)胞/ml）在 24 孔培養(yǎng)板中。感染在 37°C 下進(jìn)行 1 小時(shí)，然后在 250 μl 的接種液上添加 250 μl 覆蓋培養(yǎng)基（含 4% FCS 和 2 ml（3%）瓊脂糖的 DMEM），并在 37°C 下培養(yǎng) 3 天。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，包含病毒分離物的系列稀釋液作為陽(yáng)性對(duì)照，未感染的孔（僅培養(yǎng)基）作為陰性對(duì)照。感染 3 天后，用 500 μl 的 8% 甲醛固定覆蓋培養(yǎng)基上的清晰區(qū)（斑塊）20 分鐘。去除上清液，用 250 μl 的 1% 含晶體紫的溶液染色 5 分鐘。去除晶體紫后，用 500 μl PBS 沖洗孔。計(jì)算更稀稀釋液中的斑塊數(shù)，并將斑塊形成單位（pfu/ml）計(jì)算為斑塊數(shù) × 稀釋因子/0.25。

總 RNA 提取和 cDNA 合成

所有 RNA 提取均使用 NucleoSpin Viral RNA 試劑盒（Macherey-Nagel）按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將含有病毒顆粒的 150 μl 上清液與 600 μl RAV1 裂解緩沖液（含 45-60% 硫氰酸胍）混合，并在 BSL3 實(shí)驗(yàn)室中在 70°C 熱處理 5 分鐘。樣品隨后在 BSL2 條件下處理。從 50 μl 中取 5 微升的總 RNA，混合 2 微升反向引物混合物（E 基因特異性引物，最終濃度為 2.5 μM，6 微升水）。引物與 RNA 結(jié)合（94°C 1.5 分鐘，65°C 3 分鐘，57°C 3 分鐘），然后迅速冷卻至冰上。使用 Superscript IV（Thermofisher）合成互補(bǔ) DNA（cDNA），按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行。

qPCR 分析

所有 qPCR 分析均使用 Brilliant III Ultra-Fast SYBR Master Mixes（Agilent, Diagnostech）在 Bio-Rad CFX96 實(shí)時(shí) PCR 機(jī)器（C1000 touch 熱循環(huán)儀）上進(jìn)行。通過(guò)創(chuàng)建已知濃度的質(zhì)粒 DNA（BN2）稀釋系列（10^7 至 10^1 拷貝/反應(yīng)）為 E 基因引物組生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品（BN2 標(biāo)準(zhǔn)、cDNA 樣品和無(wú)模板對(duì)照 [NTC]）的 1 微升在 20 微升體積中進(jìn)行評(píng)估，使用優(yōu)化的熱循環(huán)程序（98°C 2 分鐘，40 個(gè)循環(huán)：98°C 5 秒，59°C 5 秒，72°C 5 秒）。完成 qPCR 后，通過(guò)熔曲線分析確定擴(kuò)增特異性。每個(gè)反應(yīng)均進(jìn)行雙重重復(fù)。

SARS-CoV-2菌株的測(cè)序

總RNA被送往Inqaba Biotechnical Industries (Pty) Ltd，一家商業(yè)NGS服務(wù)提供商進(jìn)行分析和變異菌株確認(rèn)。簡(jiǎn)而言之，RNA使用NEBNext? ARTIC SARS-CoV-2 FSLibrary制備試劑盒轉(zhuǎn)化為cDNA。根據(jù)制造商的說(shuō)明，cDNA使用VarSkip短表達(dá)協(xié)議（NEB）進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)樣本產(chǎn)生500MB的數(shù)據(jù)（2x 150 bp）。隨后，序列數(shù)據(jù)（FASTA文件）被上傳至https://clades.nextstrain.org/以確定變異。與每個(gè)變異菌株相關(guān)的特征突變通過(guò)https://covariants.org進(jìn)行確認(rèn)?；蚪M序列數(shù)據(jù)可在BioProject編號(hào)PRJNA882477下獲取。

結(jié)果

SARS-CoV-2菌株的篩選、培養(yǎng)和確認(rèn)

來(lái)自斯坦陵布什大學(xué)的同事提供了武漢株的病毒培養(yǎng)上清液。Beta、Delta和Omicron變異株的SARS-CoV-2是從殘余患者樣本中分離得到的。在30-60個(gè)樣本中篩選出變異株，除了Beta株僅回收了一個(gè)分離株外，Delta和Omicron（BA.1）分別獲得了三個(gè)獨(dú)立的分離株。這四個(gè)SARS-CoV-2分離株（武漢株、Beta株、Delta株和Omicron株）進(jìn)行了測(cè)序，以確認(rèn)譜系特征突變（見(jiàn)表2和圖1A）。

臨床患者樣本在Vero E6細(xì)胞中篩選，以分離出三種SARS-CoV-2變異株。通過(guò)qRT-PCR確認(rèn)菌株，并對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行純化，以生成每種病毒菌株的儲(chǔ)備。 (A) 每個(gè)菌株的基因組進(jìn)行了測(cè)序，并使用https://clades.nextstrain.org/確認(rèn)菌株類型。通過(guò)https://auspice.us/繪制了將這些分離株（彩色點(diǎn)）與2275個(gè)其他基因組序列（由軟件自動(dòng)選擇）進(jìn)行分類的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。克隆類型由粗體彩色線表示——野生型（20A、C和D，灰色）、Beta（紫色）、Delta（藍(lán)色和綠色）和Omicron（紅色）。 (B) 使用中位組織培養(yǎng)感染劑量（TCID）測(cè)定了分離株1（圖S1）對(duì)每種菌株的活性。將以1 x 10^5細(xì)胞/ml接種的Vero E6細(xì)胞在24小時(shí)后用各自病毒菌株的10倍稀釋液感染。細(xì)胞在72小時(shí)孵育后被染色，以評(píng)估斑塊形成作為病毒活性的指標(biāo)。所有四種菌株在Vero E6細(xì)胞單層中均顯示出復(fù)制能力，表明存在斑塊形成。

所有菌株通過(guò)qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)化為10^5-10^6個(gè)基因組當(dāng)量（見(jiàn)圖S1）。使用來(lái)自武漢、Delta和Omicron的三個(gè)分離株，以及可用的Beta分離株的三個(gè)重復(fù)樣本，評(píng)估了其復(fù)制能力，采用了TCID測(cè)定法（見(jiàn)圖1B）。武漢和Beta菌株在所有稀釋度下顯示出相似的斑塊形成能力。Delta變異株在Vero E6細(xì)胞中似乎形成了更大的斑塊，這種效應(yīng)可能是由于起始病毒材料濃度較高（見(jiàn)圖S1）。盡管Omicron變異株的起始病毒材料濃度與武漢和Beta菌株相似，但其產(chǎn)生的斑塊較少。

SARS-CoV-2病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)
在Vero E6細(xì)胞中，監(jiān)測(cè)了武漢、Delta和Omicron菌株的三個(gè)不同分離株以及一個(gè)Beta菌株的一個(gè)分離株（重復(fù)三次）的生長(zhǎng)情況，持續(xù)三天，通過(guò)qRT-PCR和TCID測(cè)定法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。所有菌株的所有分離株在72小時(shí)內(nèi)顯示出可比的生長(zhǎng)（圖2A–D）。所有菌株在感染72小時(shí)后均產(chǎn)生約6 log pfu/ml的病毒滴度，生長(zhǎng)速率相似（圖2E）。在相同的生長(zhǎng)時(shí)間點(diǎn)，超natants通過(guò)qRT-PCR定量測(cè)定病毒RNA。RNA拷貝數(shù)在72小時(shí)的生長(zhǎng)期間從每個(gè)反應(yīng)102拷貝增加到106拷貝。通過(guò)qRT-PCR和TCID測(cè)定法測(cè)量的生長(zhǎng)速率在不同分離株之間沒(méi)有差異。

在接種了1 x 10^5個(gè)細(xì)胞/ml的Vero E6細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)24小時(shí)感染了三種不同的武漢株分離株（A）、Beta變異株（B）、Delta變異株（C）和Omicron變異株（D）。每種變異株的三個(gè)單獨(dú)分離株在面板（A-D）中以從深到淺的顏色陰影表示（武漢株為藍(lán)色；Beta變異株為綠色；Delta變異株為橙色；Omicron變異株為紫色）。通過(guò)TCID測(cè)定法監(jiān)測(cè)病毒在72小時(shí)內(nèi)的生長(zhǎng)情況。（E）四種SARS-CoV-2菌株的生長(zhǎng)比較，顯示為三次生物重復(fù)的平均值，結(jié)果顯示復(fù)制適應(yīng)性沒(méi)有差異。（F）在相同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)qRT-PCR定量檢測(cè)針對(duì)E基因的病毒拷貝數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)情況。菌株的顏色與面板（E）中使用的陰影一致?；虮磉_(dá)為三次生物重復(fù)的平均值，誤差條表示均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

從干燥拭子中存儲(chǔ)后SARS-CoV-2的病毒定量

接下來(lái)，我們?cè)u(píng)估了存儲(chǔ)干燥拭子中病毒材料的保留和恢復(fù)情況及其活性。在本研究進(jìn)行時(shí)，Delta和Omicron變異株是全球主要流行的毒株，由于四種毒株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)相似，我們選擇進(jìn)一步測(cè)試這兩種變異株。我們用經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)的病毒量涂覆了五個(gè)Copan拭子，然后在4°C下孵育0小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和7天（圖3A）。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，涂覆104 pfu/ml病毒的拭子中可恢復(fù)的具有復(fù)制能力的病毒在Delta和Omicron變異株之間是相同的（圖3B）。Delta和Omicron變異株在存儲(chǔ)48小時(shí)后顯示出活性有輕微下降。存儲(chǔ)72小時(shí)后，病毒活性下降了1個(gè)對(duì)數(shù)，存儲(chǔ)7天后活性下降了2個(gè)對(duì)數(shù)（圖3B）。相比之下，通過(guò)qRT-PCR評(píng)估的病毒RNA檢測(cè)在同一時(shí)間段內(nèi)對(duì)這兩種變異株保持穩(wěn)定（圖3B）。為了研究病毒載量如何影響活性，我們用高和低數(shù)量的病毒涂覆拭子。當(dāng)拭子涂覆105 pfu/ml的Delta變異株（圖3C）和103 pfu/ml的Omicron變異株（圖3D）時(shí)，觀察到了病毒活性和RNA檢測(cè)的相同趨勢(shì)。在所有情況下，存儲(chǔ)7天后拭子上仍然存在殘余的具有復(fù)制能力的病毒。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，干燥拭子可以在4°C下存儲(chǔ)至少7天，而不會(huì)導(dǎo)致病毒RNA的降解，但活性損失為2-4個(gè)對(duì)數(shù)。接下來(lái)，我們希望評(píng)估在非常低病毒載量下接種的拭子的病毒活性和PCR信號(hào)，并在室溫和4°C下存儲(chǔ)，以重現(xiàn)臨床標(biāo)本的類似情況。為此，涂覆了102 pfu/ml的Omicron變異株在拭子上，隨后進(jìn)行存儲(chǔ)和活性及PCR信號(hào)的評(píng)估。在這兩種存儲(chǔ)條件下，24小時(shí)后未檢測(cè)到活病毒。盡管如此，7天后PCR信號(hào)沒(méi)有丟失。

討論

隨著新冠病毒（COVID-19）大流行的迅速爆發(fā)，缺乏即時(shí)的治療和疫苗選擇，疫情在短時(shí)間內(nèi)迅速達(dá)到全球?yàn)?zāi)難性水平。這導(dǎo)致診斷實(shí)驗(yàn)室因大規(guī)模檢測(cè)而不堪重負(fù)。變異株的出現(xiàn)進(jìn)一步加劇了這種情況，因?yàn)橐恍┰\斷測(cè)試需要重新評(píng)估其敏感性和特異性。據(jù)我們所知，目前尚無(wú)研究評(píng)估這些變異株在干燥拭子上的存活和恢復(fù)情況。我們證明來(lái)自武漢、Beta、Delta和Omicron譜系的分離株顯示出沒(méi)有差異的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。在相似的初始病毒載量下，所有四種毒株均能感染Vero E6細(xì)胞并以相似的速度形成斑塊。此外，對(duì)72小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的評(píng)估顯示沒(méi)有與變異株相關(guān)的差異，這表明SARS-CoV-2基因組中的突變不會(huì)影響在Vero E6細(xì)胞中的復(fù)制能力。

為了有效管理和控制每一波感染，及時(shí)檢測(cè)臨床標(biāo)本也是必要的。由于檢測(cè)試劑盒和液體運(yùn)輸介質(zhì)的嚴(yán)重短缺，拭子被干收集并在檢測(cè)前進(jìn)行水合。這通常導(dǎo)致臨床樣本的長(zhǎng)期存儲(chǔ)，迫使實(shí)驗(yàn)室和制造商尋找新的診斷方法。在資源受限、檢測(cè)量大的實(shí)驗(yàn)室中，優(yōu)先處理存儲(chǔ)拭子的檢測(cè)變得困難，結(jié)果是樣本常常在沒(méi)有診斷評(píng)估的情況下被丟棄。盡管最近的研究表明成功從長(zhǎng)期存儲(chǔ)的拭子中恢復(fù)RNA，但存儲(chǔ)對(duì)各種SARS-CoV-2變異株的存活和復(fù)制能力的影響尚不清楚（Parikh等，2021；Skalina等，2022）。我們?cè)u(píng)估了從長(zhǎng)期存儲(chǔ)的拭子中恢復(fù)的Delta和Omicron變異株的病毒RNA完整性和活性。這些是在本研究時(shí)占主導(dǎo)地位的流行株。盡管這兩種變異株在存儲(chǔ)拭子上仍然具有活性，但在7天后生長(zhǎng)下降了2-4個(gè)對(duì)數(shù)。在低病毒載量下，24小時(shí)后未檢測(cè)到活病毒。在同一時(shí)期，所有拭子的RNA通過(guò)qRT-PCR評(píng)估未出現(xiàn)降解。總體而言，我們的數(shù)據(jù)表明，SARS-CoV-2能夠在干燥拭子上存活至少一周而不喪失RNA完整性，這表明積壓樣本可以進(jìn)行有意義的診斷檢測(cè)。使用干拭子標(biāo)本具有重要的安全益處，因?yàn)樗嗽诟吡髁炕颊咦o(hù)理區(qū)域產(chǎn)生氣溶膠和感染性廢物的潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究的結(jié)果對(duì)未來(lái)與RNA病毒相關(guān)的大流行的臨床樣本檢測(cè)管理和控制具有重要意義。本研究的一個(gè)局限性是使用了已知濃度的SARS-CoV-2毒株的純化培養(yǎng)物。因此，直接從鼻咽收集的標(biāo)本的穩(wěn)定性可能會(huì)因初始病毒載量和感染點(diǎn)的不同而產(chǎn)生變異。最后，干拭子上在7天后仍存在的殘余、復(fù)制能力強(qiáng)的病毒，尤其是在高病毒載量的情況下，可能對(duì)理解SARS-CoV-2在環(huán)境中的存活具有重要意義。

數(shù)據(jù)可用性聲明
本研究中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)已存放于SARS-CoV-2變異體全基因組序列庫(kù)，訪問(wèn)號(hào)為PRJNA882477（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA882477）。

倫理聲明
涉及人類參與者的研究已獲得威特沃特斯蘭大學(xué)的機(jī)構(gòu)生物安全委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)?；颊?參與者已提供書(shū)面知情同意以參與本研究。

作者貢獻(xiàn)
BK和BG構(gòu)思了研究的整體概念。BG和CE執(zhí)行了研究的實(shí)驗(yàn)室部分。BK和BG撰寫了手稿的初稿。所有作者均對(duì)文章進(jìn)行了貢獻(xiàn)并批準(zhǔn)提交的版本。

資金支持
本工作得到了南非國(guó)家研究基金會(huì)（BK和CE）和南非醫(yī)學(xué)研究委員會(huì)（BK、BG和CE）以及國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)研究信托基金（BG）的資助支持。樣本/培養(yǎng)物的研究和開(kāi)發(fā)選擇、分型和檢測(cè)得到了比爾和梅琳達(dá)·蓋茨基金會(huì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室工程加速診斷投資（撥款號(hào)OPP1171455）提供的資金支持。

致謝
我們由衷感謝南非國(guó)家衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室服務(wù)（Dr. Lucia Hans、Dr. Kim Steegen、Dr. Pedro Da Silva）和國(guó)家傳染病研究所（Dr. Mignon Du Plessis、Mrs. Linda De Gouveia、Mr. Siyanda Dlamini）提供的SARS-CoV-2殘余患者樣本，以及斯泰倫博斯大學(xué)的Prof. Wolfgang Preiser和Dr. Tasnim Suliman提供的病毒培養(yǎng)上清液、Vero E6細(xì)胞株，并感謝他們?cè)诓《镜纳L(zhǎng)和收獲方面的指導(dǎo)。我們還要感謝Prof. Wendy Stevens、Prof. Lesley Scott、Dr. Riffat Munir和Mrs. Lara Noble在樣本選擇、分型和培養(yǎng)樣本檢測(cè)方面的貢獻(xiàn)，以及Mr. Graeme Dor提供的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理循環(huán)閾值結(jié)果。

利益沖突
作者聲明研究是在沒(méi)有任何可能被視為潛在利益沖突的商業(yè)或財(cái)務(wù)關(guān)系的情況下進(jìn)行的。

出版者聲明
本文中表達(dá)的所有觀點(diǎn)僅代表作者的觀點(diǎn)，并不一定代表其所屬組織或出版商、編輯和審稿人的觀點(diǎn)。本文中可能評(píng)估的任何產(chǎn)品或其制造商可能提出的任何聲明，并不保證或得到出版商的認(rèn)可。

補(bǔ)充材料
本文章的補(bǔ)充材料可以在以下鏈接找到：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2022.1031775/full#supplementary-material

參考文獻(xiàn)
Bai, Y., Yao, L., Wei, T., Tian, F., Jin, D. Y., Chen, L., et al. (2020). Presumed asymptomatic carrier transmission of COVID-19. JAMA 323, 1406–1407. doi: 10.1001/jama.2020.2565