妊娠和早產(chǎn)期間陰道微生物組宿主相互作用的直接拭子代謝譜分析

妊娠和早產(chǎn)期間陰道微生物組宿主相互作用的直接拭子代謝譜分析

IF:16.6 Nature communications  2021.10  帝國醫(yī)學(xué)院 英國

研究概述

在懷孕期間，由上陰道感染引起的妊娠組織(如宮頸、胎膜)炎癥被認(rèn)為是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要因素，并且是5歲以下兒童死亡的主要原因。本研究收集了兩個獨立妊娠孕婦隊列的宮頸陰道分泌物，使用解吸電噴霧電離質(zhì)譜法(DESI-MS)直接在棉簽樣本上檢測代謝譜。通過整合隊列樣本的16s擴增子測序和免疫譜數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)特定的代謝組特征可以用于預(yù)測陰道微生物群的組成和宿主的炎癥狀態(tài)，從而揭示陰道微生態(tài)失衡和先天免疫激活與早產(chǎn)有關(guān)。

研究背景

陰道微生物組是生殖道病理生理學(xué)研究的關(guān)鍵介質(zhì)。健康人群的陰道微生物組中乳酸桿菌物種占據(jù)優(yōu)勢，在營養(yǎng)物質(zhì)有限的情況下，乳酸桿菌可通過其優(yōu)勢生長競爭性地消耗潛在致害菌的營養(yǎng)素，這種競爭有限營養(yǎng)素的能力是決定菌群分布的重要因素，因此乳酸菌種類的減少和其他微生物多樣性的增加是細菌性陰道?。˙acterial Vaginosis，BV）的特征，產(chǎn)生次優(yōu)陰道微生物群組成(VMC)。VMC與宿主先天免疫反應(yīng)和炎癥的激活受共同機制途徑調(diào)節(jié)，而乳桿菌等益生菌屬的存在可以改變宮頸陰道黏膜的代謝環(huán)境而抑制這一過程的發(fā)生。

宮頸環(huán)扎術(shù)是一種手術(shù)，用于加強因?qū)m頸縮短而有早產(chǎn)風(fēng)險女性的子宮頸。最新報道表明，宮頸環(huán)扎術(shù)如若使用辮狀而不是單絲環(huán)扎材料進行，可能誘發(fā)陰道細菌性生態(tài)失調(diào)、炎癥激活和宮頸過早成熟，這與早產(chǎn)風(fēng)險增加有關(guān)。高度多樣性及BV相關(guān)的陰道微生物群也與HPV感染、宮頸發(fā)育不良、受精失敗、流產(chǎn)和早產(chǎn)有關(guān)。在妊娠期間，產(chǎn)婦陰道感染引起的妊娠組織(如宮頸、胎膜)炎癥將會過早激活胎兒的免疫系統(tǒng)，最終可能導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)。

因此，需要一種方便、快捷的檢測手段去取代常規(guī)檢測樣品制備的復(fù)雜程序，以便快速對女性陰道微生物群進行檢測和潛在的早產(chǎn)干預(yù)治療。

研究方法

在本研究中，作者共招募了兩個獨立的婦女隊列（圖1A)，兩個隊列中的婦女年齡、BMI、妊娠狀態(tài)和種族相似。隊列一（VMET）共招募了160名女性，在她們的整個妊娠期間進行縱向采集（共455個拭子樣本）。這些樣本采用解吸電噴霧電離質(zhì)譜法（DESI-MS）進行代謝分析，并使用另外五種液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS)進行跨平臺比較。隊列二（VMET2）共招募205名女性，在與隊列一類似的時間點縱向采樣(共573個拭子樣本)，樣本除經(jīng)DESI-MS代謝特征分析外，還有部分用于免疫譜研究。此外，兩個隊列的樣本均進行了16s擴增子測序分析。

作者使用了多種預(yù)測模型來評估妊娠期陰道棉簽拭子樣本中代謝產(chǎn)物是否可用于監(jiān)測早產(chǎn)和妊娠期間使用的臨床干預(yù)（例如宮頸環(huán)扎術(shù)）相關(guān)的陰道微生物組成變化和宿主炎癥反應(yīng)。

圖1：使用DESI-MS代謝譜能可靠的預(yù)測宮頸陰道液微生物組組成

研究結(jié)果

1. 通過拭子DESI-MS預(yù)測VMC

針對VMET和VMET2兩個隊列樣本，使用16s擴增子測序，并基于OUT的Jensen-Shannon距離矩陣進行Ward's Linkage層次聚類分析，將陰道樣本分為11個不同的組（圖2）。

圖2：VMET和VMET2研究中16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)的分層聚類分析圖

使用Silhouette評分進行評估，最終在兩個隊列中共確定了六個主要的菌群類型（community state types，CSTs）：（1）CST I（L. crispatus）；（2）CST II （L. gasseri）；（3）CST III(L. iners)；（4）CST IV(Gardnerella vaginalis)；（5）CST V(L. jensenii)；（6）CST VII(other Lactobacillus spp.)（圖3），而CST VI (Bifidobacterium breve) 則為VMET2特有的菌群類型。在屬的水平上，將七個菌群類型分成兩個群，CST I、II、III、V、VII歸屬于乳酸菌優(yōu)勢群（Lactobacillus-dominated，LDOM），而CST IV、VI歸屬于乳酸菌劣勢群（Lactobacillus-depleted , LDEPL）。使用線性混合效應(yīng)模型，在對兩個患者隊列的獨立分析中，發(fā)現(xiàn)在DESI-MS的負離子和正離子模式下確定的總共113種代謝物特征在LDOM和乳酸菌劣勢LDEPL兩個群之間有顯著區(qū)別（圖3）。

圖3：VMET和VMET2研究中6種主要的主要的微生物群落狀態(tài)類型

作者使用隨機森林分類法和ROC-curve分析，對DESI-MS預(yù)測VMC的性能進行評估。在負離子極性模式(VMET/VMET2; AUC 94.1/90.6; sensitivity: 62.0/54.5; specificity: 97.8/96.4)下，患者隊列中對LDOM和LDEPL的預(yù)測結(jié)果顯著，對幾種主要的陰道CST（CSTI，III和IV）之間的區(qū)分明顯，表明可以通過直接拭子的DESI-MS法檢測來實現(xiàn)對VMC的預(yù)測。

圖4：不同陰道微生物群組成之間DESI-MS分類性能比較

2. 陰道共生菌和致病菌分離株的體外 DESI-MS 分析

接下來，作者對陰道菌群中CST主要成員的細菌物種進行培養(yǎng)并鑒定了培養(yǎng)分離物(n = 25)，對比體外培養(yǎng)與體內(nèi)陰道代謝物是否一致。在校正了背景培養(yǎng)基濃度后，通過DESI-MS在培養(yǎng)菌落拭子中檢測到27種與體內(nèi)鑒定相同的代謝物(圖5)。大約一半的代謝物的檢測水平低于培養(yǎng)基背景對照，而其余代謝物的檢測水平高于培養(yǎng)基背景。然而，在體外培養(yǎng)菌群的這些代謝物的DESI-MS水平和CST成員與活檢觀察到的水平之間沒有明顯的關(guān)系。

圖5：通過DESI-MS檢測到的27種體內(nèi)的特異性代謝產(chǎn)物

3. 直接拭子DESI-MS法評估宿主粘膜間的免疫應(yīng)答反應(yīng)

作者使用VMET2隊列樣本的一個子集（共391個拭子樣本），檢測了22種可溶性免疫標(biāo)志物，包括細胞因子、趨化因子、免疫球蛋白和補體系統(tǒng)組成成分等（圖6A）。采用隨機森林回歸分析，利用DESI-MS衍生的特征來預(yù)測每個標(biāo)記物的對數(shù)轉(zhuǎn)換濃度。

最終觀測到免疫標(biāo)記物的CVR2 > 0.1 (n = 9)和DESI-MS特征與免疫標(biāo)記物的線性回歸(n = 23)，顯示代謝特征與局部免疫表型密切相關(guān)，主要特征是長鏈脂肪酸、甘油磷脂和神經(jīng)酰胺水平的改變(圖6B)。

DESI-MS預(yù)測和免疫分析測定的C3b、IL-1β、IgG2和IgG3水平在乳酸菌缺失的陰道微生物群中均升高，表明局部先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活（圖6C）。

圖6：使用直接拭子DESI-MS評估宿主粘膜間的免疫反應(yīng)

4. 直接拭子DESI-MS法作為早產(chǎn)風(fēng)險分層的潛在工具

作者結(jié)合VMET1和VMET2患者隊列的所有可用數(shù)據(jù)，研究了DESI-MS預(yù)測的妊娠結(jié)果、VMC和炎癥狀態(tài)之間的關(guān)系。使用16s 擴增子測序法定義了LDOM和LDEPL的陰道菌群類型，發(fā)現(xiàn)與在整個妊娠期間保持乳酸菌優(yōu)勢（LDOM）的婦女相比，婦女妊娠期間陰道菌群的高多樣性和不穩(wěn)定性（如妊娠期間陰道菌群類型由LDOM向LDEPL變化），與早產(chǎn)風(fēng)險增加相關(guān)（比值比（OR）1.97，95%置信區(qū)間（CI）1.03-1.66，p=0.04）（圖7A）。

通過免疫測定法直接測定或通過DESI-MS法預(yù)測IL-1β水平升高與足月分娩或早產(chǎn)婦女的VMC高度多樣性有關(guān)（圖7B,C），而MBL水平升高與早產(chǎn)婦女的VMC高多樣性有關(guān)（圖7C）。

圖7：陰道微生態(tài)失衡和免疫激活與宮頸環(huán)扎術(shù)后早產(chǎn)風(fēng)險和不良妊娠結(jié)局相關(guān)

作者隨后將分析集中在更可能與陰道微生物-宿主相互作用失調(diào)相關(guān)的早產(chǎn)表型上，對比了在宮頸環(huán)扎術(shù)中使用辮狀編織材料和使用單絲環(huán)扎材料進行手術(shù)的兩類早產(chǎn)高風(fēng)險婦女，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與術(shù)中使用單絲縫合的女性相比，使用編織材料進行宮頸環(huán)扎術(shù)的患者陰道MBL水平最常升高(圖7D)，使用DESI-MS法分析陰道拭子的VMC和MBL水平時，也檢測到了類似的情況。免疫測定的結(jié)果也表明編織環(huán)扎插入后IL-1β升高（圖7E），但DESI-MS預(yù)測檢測的一致性較差。在用編織環(huán)扎材料治療后，DESI-MS準(zhǔn)確地預(yù)測了足月分娩的婦女與隨后分娩的早產(chǎn)婦女相比IL-5β水平較低（圖7F）。

小Q提示

作者通過利用宮頸陰道粘膜內(nèi)的菌群和代謝物信息來提供VMC的可靠檢測并同時估計宿主免疫和炎癥狀態(tài)。這本研究中，作者使用DESI-MS檢測法對VMC進行預(yù)測，能夠監(jiān)測陰道微生物組的多樣性及在整個懷孕期間的穩(wěn)定性，最終達到預(yù)測早產(chǎn)風(fēng)險分層，優(yōu)化預(yù)防性干預(yù)措施的效果?？傊髡叩难芯勘砻?，直接拭子上的DESI-MS可以快速、可靠地評估反映在宮頸-陰道粘膜代謝組中的陰道微生物群-宿主免疫相互作用。

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