系統(tǒng)優(yōu)化尿液DNA提取用于微生物組測序

DNA 測序技術(shù)的最新進展使得能夠使用獨立于培養(yǎng)的技術(shù)來表征人體不同部位的微生物群落。使用這些方法的研究表明，尿道含有多種微生物種群，稱為尿微生物組。泌尿微生物組的變化與尿路感染和盆腔疼痛綜合征等泌尿系統(tǒng)疾病有關(guān)。然而，由于尿液中生物量低且存在 PCR 抑制劑，從尿液樣本中提取 DNA 和測序仍然具有挑戰(zhàn)性。許多研究表明，很大一部分尿液樣本的 DNA 測序深度或回收率較差。本研究的目標是系統(tǒng)地優(yōu)化專門針對尿液的 DNA 提取方案，以提高微生物 DNA 產(chǎn)量。

使用什么方法來優(yōu)化 DNA 提取方案？

研究人員使用健康受試者的標準化尿液樣本測試了對常用商業(yè) DNA 提取試劑盒的多種修改。他們使用定量 PCR 和真菌特異性引物評估了每個步驟的真菌 DNA 產(chǎn)量。評估了以下參數(shù)：

（1）離心速度：1500、5000或16000 RCF

（2）酶消化：溶菌酶、裂解酶或兩者一起分解細菌和真菌細胞壁

（3）機械破壞：用二氧化硅珠打珠

（4）熱破壞：加熱和冷凍循環(huán)

（5）蛋白酶 K 消化：濃度從 12 到 144 mAU/ml

（6）載體DNA的使用

（7）樣品量：1至50毫升

（8）用于柱結(jié)合的樣品等分試樣大?。?00 至 400 μl

（9）柱結(jié)合前合并等分試樣

優(yōu)化 DNA 提取方案產(chǎn)生了哪些關(guān)鍵結(jié)果？

（1）01500 RCF 的較低離心速度可獲得最佳 DNA 產(chǎn)量

（2）溶菌酶和裂解酶聯(lián)合消化可提高產(chǎn)量

（3）珠磨和熱破壞步驟都很重要

（4）24 mAU/ml 蛋白酶 K 是最佳濃度

（5）添加載體 DNA 提高回收率

（6）25-30 ml 起始尿量可提供最大的微生物多樣性

（7）以約 250 μl 的較小等份處理樣品可提高產(chǎn)量

（8）柱結(jié)合前匯集等分試樣可提高 DNA 回收率

與標準方法相比，優(yōu)化方案的表現(xiàn)如何？

優(yōu)化的 DNA 提取方案針對三種廣泛使用的商業(yè)試劑盒進行了測試。與商業(yè)試劑盒相比，新方法顯著提高了尿液樣本中細菌和真菌 DNA 的產(chǎn)量，其中真菌產(chǎn)量增加了 200%。它還增強了陰道拭子中微生物 DNA 的回收率。下一代測序表明，與其他方法相比，優(yōu)化的方案提供了更全面的真菌和細菌多樣性表征。

開發(fā)改進的 DNA 提取方案有何意義？

這項系統(tǒng)優(yōu)化研究確定了最大限度地從低生物量尿液樣本中提取微生物 DNA 所需的關(guān)鍵修改。增強的方案可以更有效和更具代表性地表征尿液微生物組，包括尚未得到充分研究的真菌。通過提高微生物 DNA 產(chǎn)量和多樣性，該方法可以幫助建立正常的尿液微生物特征并識別與泌尿系統(tǒng)疾病相關(guān)的變化。優(yōu)化的 DNA 提取對于利用測序等獨立于培養(yǎng)的技術(shù)來闡明尿液微生物組在健康和疾病中的作用至關(guān)重要。

參考文獻

Ackerman AL, Anger JT, Khalique MU, Ackerman JE, Tang J, Kim J, Underhill DM, Freeman MR; NIH Multidisciplinary Approach to the Study of Chronic Pelvic Pain (MAPP). Optimization of DNA extraction from human urinary samples for mycobiome community profiling. PLoS One. 2019 Apr 25;14(4):e0210306. doi: 10.1371/journal.pone.0210306. PMID: 31022216; PMCID: PMC6483181.

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